蜜柚类胡萝卜素代谢相关基因的分离及功能分析

作     者：金晓琴 

作者单位：浙江师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨莉

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：类胡萝卜素代谢 蛋白互作 泛素连接酶 细胞色素P450 

摘      要：类胡萝卜素是存在于自然界的天然色素之一,除能够赋予植物各种色彩之外,还有丰富的营养价值。其中番茄红素具有抗癌作用,p-胡萝卜素含有两个维生素A1的环结构,能够高效转化为维生素A,补充生物体维生素A含量。因此,研究类胡萝卜素代谢机制对于提高植物天然类胡萝卜素含量,尤其是可食用部位类胡萝卜素含量十分重要。类胡萝卜素主要的代谢途径涉及PSY, PDS, ZDS, ZISO, CrtISO, LYCB, LYCE及BCH。除了CrtISO与BCH这2个基因外,其余6个基因全长均从红肉蜜柚及琯溪蜜柚中得以分离,并比较分析了这些基因在果实发育过程中的基因表达模式。结果发现,红肉蜜柚果实汁胞中番茄红素与p-胡萝卜素含量较琯溪蜜柚高,但上述基因所编码的氨基酸仅存在个别氨基酸差异或无差异。此外,我们再次分析了红肉蜜柚与琯溪蜜柚果实汁胞中番茄红素代谢相关基因的表达。除CgZISO外,其他番茄红素合成的上游基因(CgPSY, CgPDS与CgZDS)基本都随着蜜柚果实的成熟表达量升高,下游基因(CgLYCB与CgLYCE)则相反,随着蜜柚果实的成熟表达量反而降低。但是CgZISO作为番茄红素合成的上游基因,其表达量的趋势总体上与两个下游基因表达模式一致,与其他三个上游基因表达模式相反。利用酵母双杂交技术,对番茄红素代谢过程中主要的六个酶进行互作研究,结果与实验室前期BiFC结果基本一致。CgPSY能够与CgPDS、CgZDS、CgLYCB发生相互作用(CgLYCE未能同时转进酵母,所以其互作情况尚未知);CgZDS和CgPDS能够与CgPSY、CgZISO、CgLYCB与CgLYCE这几个酶之间发生相互作用,CgZDS与PDS两者之间也有互作关系;CgZISO比较特殊,只与CgPDS和ZCgDS这两个脱氢酶发生相互作用;CgLYCB与CgLYCE类似,都能够与CgPSY、CgPDS、CgZDS发生互作,CgLYCB与CgLYCE之间也具有相互作用。从红肉蜜柚与琯溪蜜柚中分别分离出一个RING-H2 finger (CgRHF)基因,二者DNA序列无差异,属于C3H2C3型RING E3连接酶家族成员。BiFC分析表明无论是红肉蜜柚还是琯溪蜜柚,CgRHF能不同程度的与CgPSY、CgZDS、CgLYCB和CgLYCE相互作用;与红肉蜜柚CgPDS存在较弱的相互作用,与琯溪蜜柚CgPDS无互作。同时,我们在番茄果实中沉默CgRHF基因的非保守片段,发现成熟沉默番茄果实颜色较对照浅,果实中类胡萝卜素含量,特别是番茄红素与p-胡萝卜素含量有所减少,推测CgRHF基因与类胡萝卜素代谢有关,可能参与调控类胡萝卜素的合成代谢。对蜜柚CYP450进行分离与qPCR分析,结果所分离的CgCYP450基因隶属于CYP86A8家族,主要参与脂肪酸的代谢,并且该基因随着蜜柚果实的发育及番茄红素的积累,其表达逐渐降低。BiFC分析发现所分离的CYP450与类胡萝卜素代谢相关酶无任何互作。此外,沉默CgCYP450基因片段后仅影响了沉默植株茎组织的发生。