MBV、SRV、SIV血清抗体调查及间接ELISA检测方法的初步建立

作     者：杨燕飞 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：薛整风;高诚

授予年度：2016年

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猴B病毒 猴D型逆转录病毒 猴免疫缺陷病毒 间接ELISA 

摘      要：猴B病毒(Monkey B virus, MBV)是普通级实验猴的必须检测项目,要求阴性,可感染多种动物和人,人感染后的死亡率高达80%,幸存者有神经后遗症,而猴感染后仅表现轻微的疱疹症状或无症状,但长期带毒、间歇排毒,其潜伏感染的特性常造成假阴性检测结果。MBV只有一个血清型,抗原性稳定,其核苷酸序列和氨基酸序列己确定,囊膜糖蛋白gD被证实有较高的诊断潜能。猴D型逆转录病毒(Simian type D Retrovirus, SRV)、猴免疫缺陷病毒(Simian Immunodeficiency Virus, SIV)是SPF级实验猴的必需检测项目,要求阴性。SRV和SIV是猴艾滋病的病原,感染后都会引起免疫缺陷症状,但是SIV在其天然宿主不致病,只有跨种群感染才会导致猴艾滋病的发生。SRV有7个血清型,其中1～3己测序完成,核衣壳蛋白p27的氨基酸序列高度保守。SIV衣壳蛋白p27含有主要抗原决定簇,且具有群抗原性,被认为是SIV抗原检测的标志物。本实验主要从以下三方面开展：1.上海地区实验用猴MBV、SRV、SIV三种病毒的血清抗体调查共检测475份血清样本,MBV血清抗体阳性34份,阳性率7.158%;SRV血清抗体阳性20份,阳性率4.211%;SIV血清抗体阳性1份,阳性率0.2105%,阳性率与年份和样本总数没有相关性。2.目的蛋白的表达、纯化及鉴定将pET28a-gD (MBV)质粒转化到BL21(DE3)菌株,表达MBV gD蛋白,分子量约为48.24kD,经镍琼脂糖亲和层析纯化后,用Western blot证明该蛋白具有抗原性,测得蛋白浓度为3.726mg/mL。将pET28b-p27 (SRV)质粒转化到tosetta (DE3)菌株,表达SRV p27蛋白,分子量约为26.2kD,经镍琼脂糖亲和层析纯化后,用Western blot证明该蛋白具有抗原性,测定蛋白浓度为2.043mg/mL。将pET28a-p27 (SIV)质粒转化到Rosetta (DE3)菌株,表达SIV p27蛋白,分子量约为24.6kD,经镍琼脂糖亲和层析纯化后,用Western blot证明该蛋白具有抗原性,测定蛋白浓度为1.604mg/mL3.间接ELISA方法的建立及评价用4BV gD蛋白作为抗原,建立检测MBV血清抗体的间接ELISA方法,确定的最佳反应条件为：抗原1：1280稀释(浓度为2.913μg/孔);血清1：100稀释,作用60min;酶标抗体1：20000稀释,作用60min,底物显色15min。OD值≥0.326判为阳性,OD值≤0.255判为阴性。实验证明gD蛋白不与***发生交叉反应,所建立的方法与全病毒试剂盒检测结果的符合率为96.74%,批内重复试验中阴、阳对照的OD值变异系数小于14%。应用该方法检测2016年上海地区送检的37份猴血清,检出阳性1份,阳性率为2.703%。用SRVp27蛋白作为抗原,建立检测SRV血清抗体的间接ELISA方法,确定的最佳反应条件为：抗原1：640稀释(浓度为3.193μg/孔);血清1：100稀释,作用6Omin;酶标抗体1：20000稀释,作用60min,底物显色15min。OD值≥0.297判为阳性,OD值lt;0.244判为阴性。实验证明p27蛋白不与***发生交叉反应,所建立的方法与全病毒试剂盒检测结果的符合率为97.87%,批内重复试验中阴、阳对照的OD值变异系数小于9%。应用该方法检测2016年上海地区送检的37份猴血清,检出阳性2份,阳性率为5.405%。用SIV p27蛋白作为抗原,建立检测SIV血清抗体的间接ELISA方法,确定的最佳反应条件为：抗原1：640稀释(浓度为2.508μg/孔);血清1：100稀释,作用60min;酶标抗体1：10000稀释,作用60min,底物显色15min。OD值≥0.269判为阳性,OD值≤0.256判为阴性。实验证明p27蛋白不与MBV、SRV发生交叉反应,所建立的方法与全病毒试剂盒检测结果的符合率为98.91%,批内重复试验中阴、阳对照的OD值变异系数小于3%。应用该方法检测2016年上海地区送检的37份猴血清,检出阳性0份,阳性率为0。