虎纹蛙MHCⅠ类、Ⅱ类基因的克隆与多态性分析

作     者：程岩岩 

作者单位：浙江师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邵晨

授予年度：2016年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：MHC基因 多态性 正选择 虎纹蛙 

摘      要：MHC (Major histocompatibility complex)即主要组织相容性复合体,是脊椎动物中直接介导免疫反应的一类细胞表面蛋白。MHC基因即是编码这类蛋白的基因家族,许多的研究已经表明MHC基因家族是脊椎动物体内变异最大的功能基因之一,具有较高的其变异主要出现在抗原结合部位,因为该部位与动物抵抗病原体的能力以及对环境的适应性直接相关,所以很多研究集中分析这个变异最大的区域。对于MHC Ⅰ类、Ⅱ类基因来说,exon3与exon2分别编码其抗原结合部位,是变异最大的区域,了解该区域的变异特性能为进一步研究生态学中的适应性进化、性选择等问题提供便利。而目前两栖类MHC基因的结构特点和进化模式的研究非常有限,为了更加系统全面的了解两栖类MHC基因的多态性情况,本研究的目标是从虎纹蛙(Hoplobatrachus chinensis)中克隆MHC Ⅰ类exon3基因与Ⅱ类exon2基因,并分析其多态性的维持机制。本文首先通过设计通用引物成功的获得了MHC基因Ⅰ类exon3 126bp, MHC Ⅱ类exon2 132bp。我们通过常规PCR方法以及Genomic Walking的方法共获得虎纹蛙MHC Ⅰ类基因1020bp,Ⅱ类基因2020bp,其中包含了全部的外显子部分。通过设计虎纹蛙特异性引物分别扩增虎纹蛙MHC Ⅰ类exon3与Ⅱ类exon2。然后在碧莲、大若岩与下廖三个种群中检测虎纹蛙的MHC Ⅰ类、Ⅱ类基因的多态性。获得了如下的研究结果：1、在27个野生虎纹蛙个体中检测出Ⅰ类等位基因10条,而在一个个体中最多达到了7个,表明虎纹蛙MHC Ⅰ类基因最少具有4个基因座;II类等位基因检测到7条等位基因,在一个个体中最多达到3个等位基因,表明虎纹蛙MHC Ⅱ类基因最少有2个基因座。2、通过DNAsp软件计算出其I类基因的10条等位基因的核苷酸序列变异位点为27.3%;II类基因的7条等位基因的核苷酸序列变异位点为13%。3、通过MEGA6.0计算所得到等位基因的氨基酸距离以及核苷酸距离,结果得到MHCⅠ类与Ⅱ类的氨基酸距离均大于核苷酸距离,暗示其经历过正选择,4、利用MEGA与一些其他在线程序一共检测到Ⅰ类6个正选择位点,其中有3个位于假定的抗原结合区;Ⅱ类一共检测到5个正选择位点,其中有两个位于抗原结合区。所以,我们得出虎纹蛙的MHC基因受到的正选择作用可能与寄生虫调控的平衡选择有关。5、通过构建系统进化发育树以及GRAD在线检测,均未发现有重组现象以及跨物种多态性。本研究为以后虎纹蛙的后续研究提供了较好的理论基础和分子标记。1、可以作为一种与功能相关的分子标记来研究虎纹蛙的不同地理种群的地理变异,也可以将虎纹蛙和其它两栖类联系起来系统的阐释两栖类基因的进化模式。2、可以将该基因与虎纹蛙抵抗病原菌的能力联系起来,揭示虎纹蛙抗病的分子机制。3、可以用该基因与虎纹蛙的配偶选择联系起来,揭示虎纹蛙的配偶选择机制。