牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选

作     者：朱玲 

作者单位：石河子大学 

学位级别：硕士

导师姓名：剡根强

授予年度：2018年

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：牛源多杀性巴氏杆菌 荚膜血清A型 疫苗菌株 免疫保护 抗体效价 

摘      要：目的:为了能够筛选出生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)灭活苗候选菌株,本试验选取6株经分离和鉴定的来自新疆不同地区发病牛场,导致犊牛肺炎而死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,对其进行生长曲线测定,药物敏感性试验,小鼠毒力测定,菌体脂多糖(LPS)含量测定,各菌株灭活苗免疫小鼠、家兔后抗体测定、攻毒保护试验以及犊牛免疫效果测定。方法:试验一:不同Pm分离株生长特性、菌体LPS含量以及药物敏感性测定。将6株分离株的纯培养物进行革兰氏染色与镜检,观察染色及形态特征,确保各菌株为纯培养物。采用活菌计数法(CFU)和菌液吸光度(OD值)的方法检测6株菌生长曲线并进行比较;用LPS提取试剂盒分别提取6株分离株的LPS,分别测定6株分离株LPS的核酸含量、多糖含量、蛋白含量;采用纸片法对6株分离株进行药物敏感性测定。试验二:不同Pm分离株毒力基因及小鼠致病性测定提取不同Pm分离株的DNA,参照与荚膜形成相关基因ceaA基因、细菌黏附相关基因fimA基因、四型菌毛相关基因ptfA基因以及与铁获得因子相关基因tbpA基因序列设计特异性引物分别进行PCR扩增;采用小鼠腹腔注射法,对6株Pm菌株进行小鼠半数致死量(LD)测定。试验三:不同Pm分离株灭活菌苗的制备及免疫效果测定灭活菌苗的制备:将6株分离株分别进行扩大培养,活菌计数,经甲醛灭活后,用ISA 206双相佐剂制备Pm灭活油佐剂疫苗,对所制备菌苗进行无菌检测、物理性状的检测、疫苗的稳定性检测、疫苗保存时间试验、动物安全性试验等检测;小鼠、家兔动物免疫效果测定:将制备的6株灭活苗分别皮下免疫小鼠及家兔后观察小鼠和家兔的食欲,精神状况,以及家兔体温变化,二免后14d采用已建立的IHA方法对免疫小鼠、家兔的血清进行抗体测定;犊牛免疫效果测定:选择小鼠、家兔血清抗体效价较高的分离株灭活苗进行犊牛免疫试验;观察并记录免疫犊牛健康状况,并于二免14d采集犊牛血清进行抗体检测。结果:1.六株Pm分离株的生长曲线相似,其中Pm2、Pm3、Pm5分离株生长较快;Pm1、Pm4、Pm6分离株生长较慢。Pm3分离株LPS中的核酸含量、多糖含量、蛋白含量最高,Pm5、Pm2菌株含量次之;其余菌株含量较少。药物敏感性试验表明:6株分离株对同种药物的敏感性相似,都对庆大霉素、氧氟沙星的敏感性较高,对新霉素、环丙沙星的敏感性不高,对氨苄西林钠几乎不敏感。2.毒力因子检测表明,6株分离株均含四型菌毛相关基因ptfA与黏附相关基因fimA;小鼠半数致死量(LD)测定表明分离株Pm1、Pm2、Pm3、Pm4、Pm5、Pm6的LD分别为10、10、10、10、10和10.52.52 CFU/mL。其中Pm3菌株毒力最强;3.所制灭活菌苗无杂菌污染、粘度符合要求、离心后无分层、稳定性良好;小鼠、家兔免疫保护性试验结果显示:Pm2、Pm3、Pm5分离株制备的灭活苗免疫小鼠、家兔后抗体效价高,达到1∶64∶128,且对其进行强毒攻毒后能全部存活,PBS对照组则全部死亡,免疫家兔产生的副反应较小,而Pm1、Pm4、Pm6抗体效价较低且对家兔产生的副反应较大;对Pm2、Pm3、Pm5这三株分离株制备的灭活苗进行犊牛免疫试验,免疫后犊牛采食量正常,且精神状态良好,体温在免疫1天内稍有上升后又恢复正常,对犊牛产生的副反应均较小,二免14 d后对犊牛血清进行抗体效价测定,结果Pm3菌株制备的灭活苗抗体效价较Pm2、Pm5高。6头免疫犊牛3头血清抗体达到1∶32,一头达到1∶64。结论:研究结果表明,六株不同Pm分离株中Pm3和Pm5株纯化后形态特征稳定、生长速度快、LPS含量高、携带两个主要毒力基因,对试验动物的致病力强;制备的灭活菌苗免疫小鼠家兔攻毒后达到100%的保护率;免疫犊牛后副反应小、免疫抗体水平高,可作为牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌灭活苗的候选株,其中Pm3菌株可作为首选株。研究结果为进一步研发此菌苗提供了菌株支持。