光呼吸在番茄防御Pseudomonas syringae中的作用与机制研究

作     者：张冠群 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：师恺

授予年度：2014年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090202[农学-蔬菜学] 

主      题：番茄 光呼吸 Rst DC3000 CFU 抗性 SA 过氧化氢 抗氧化酶 基因表达 VIGS 

摘      要：番茄(Solanum lycopersicum L.)是目前设施栽培面积最大的蔬菜品种之一,2010年全球番茄总产量达1.46亿吨。在设施番茄培育中,病虫害的侵害严重影响了植株的生长以及品质、产量。其中丁香假单胞菌番茄变种(Pseudomonas syringae *** strain DC3000,Pst DC3000)所引发的番茄细菌性斑点病在辽宁、福建、内蒙古、新疆、广西、河北、甘肃、吉林、天津等省市区均有发生,该病主要危害番茄叶、茎、花、叶柄和果实,可造成5%-75%的产量损失。研究植物抗病作用机制对于提升植物自身抗性、减少化学杀菌剂的使用具有重要的理论指导意义。近几十年的研究表明光呼吸在调控植物光抑制、氨基酸含量和抗逆等方面都发挥着重要作用。本文以番茄品种浙杂205 (Solanum lycopersicum L. cv. Zheza 205)为试验材料,初步探索了光呼吸调控番茄对Pst DC3000的防御影响及其内在机制。所取得的主要研究结果如下：1、研究了外源光呼吸抑制剂的喷施对番茄防御Pst DC3000的影响,以番茄品种浙杂205为实验材料,喷施不同浓度的光呼吸抑制剂NaHSO3和异烟肼INH,测定光呼吸、光呼吸关键酶乙醇酸氧化酶(GOX)活性及FV/FM等指标,发现INH处理能显著降低GOX活性和光呼吸而不影响其正常生长,最终选用0.2g/L的INH作为光呼吸抑制剂处理。接种Pst DC3000后,INH处理的植株更加敏感,死细胞数、电解质渗透率、细菌菌落数(CFU)明显多于对照,H2O2处理能显著提高番茄对Pst DC3000的抗性,INH和H2O2的复合处理能将其抗病性恢复到对照水平。通过测定H2O2的含量、水杨酸(SA)相关基因表达、抗氧化酶基因表达等,推测光呼吸过程中产生的H2O2作为信号物质在番茄防御Pst DC3000的过程中可能起到积极的作用。2、利用病毒介导的基因沉默技术(VIGS)验证光呼吸调控番茄防御Pst DC3000的机制。沉默了光呼吸途径中的三个关键基因(GOX)、丝氨酸-乙醇酸氨基转移酶(SGT)和丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT),并对基因沉默植株喷施H2O2进行进一步的实验。实验结果表明,光呼吸关键基因沉默植株对Pst DC3000抗性明显下降,CFU、渗透率明显高于对照;喷施H2O2后,GOX沉默植株的抗氧化酶基因以及SA相关信号基因上调,对Pst DC3000的抗性增加,而H2O2的喷施对SGT, SHMT沉默植株没有明显影响,表明H202介导GOX调控番茄的抗病性,而SGT、SHMT可能通过直接影响SA的合成进而调控番茄抗病性。3、利用烟草瞬时表达系统进一步研究了光呼吸相关蛋白GOX、SGT、SHMT的瞬时表达对其防御假单胞菌的影响。叶片注射带有重组质粒的农杆菌36h后即可检测到相应蛋白的表达。研究表明,三个光呼吸关键酶的瞬时表达均能提高烟草的抗病性,注射H202的处理与未注射的处理没有差异;注射H202的专一清除剂二甲基硫脲(DMTU),只有GOX瞬时表达的烟草对病菌的敏感性提高,而SGT、SHMT瞬时表达的烟草对病菌的抗性与未喷施DMTU的处理差异不大,表明H202介导GOX调控植物抗病性的影响,而SGT、SHMT可能通过其他途径调控植物抗病性,进一步验证了基因沉默植株的处理效果。