亚洲玉米螟幼虫细胞色素P450基因的克隆及苯巴比妥钠对其的诱导作用

作     者：邓雪华 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：冯纪年

授予年度：2006年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：玉米螟 细胞色素P450 细胞色素b5 

摘      要：本文对亚洲玉米螟幼虫基因组DNA的提取、细胞色素P450基因的克隆、序列分析以及苯巴比妥钠对细胞色素P450酶系的诱导作用等方面进行了探讨研究。亚洲玉米螟Ostrinia furnacalis(Guenée)是世界性重要害虫之一,严重危害农业生产;细胞色素P450是一种广泛存在于生物体内的重要酶系,并能代谢多种内源性和外源性物质,因而颇受关注。本研究结果如下: 1、玉米螟幼虫基因组DNA的提取 分别采用三种不同的方法,SDS-蛋白酶K消化法、CTAB法和基因组试剂盒对玉米螟幼虫DNA提取方法进行了探索研究。结果表明,对于新鲜的玉米螟标本,三种方法都可以得到质量较高的DNA样本;而保存于无水乙醇中的样本幼虫,不同的方法提取的DNA样本质量有所差异。 2、细胞色素P450基因片段的克隆及序列分析 根据细胞色素P450CYP4家族的保守序列设计了一对P450基因的特异性引物,应用PCR扩增的方法,从亚洲玉米螟幼虫基因组DNA中得到了一条特异性条带,将这个条带纯化后与pGEM-T easy载体进行重组,然后克隆至大肠杆菌DH 5α,筛选并测定了1个阳性克隆。经测序得到一条长度为603bp的特异性DNA片段,编码201个氨基酸。将此氨基酸序列与Genbank中已知序列采用Blast及ClustalW EBI软件进行同源性分析,结果表明该氨基酸序列与CYP4家族的同源性较高,达37%～53%,推测此序列为CYP4家族的一员,GenBank登录序列号为DQ282635。 3、苯巴比妥钠对玉米螟细胞色素P450和b的诱导作用 将苯巴比妥钠配制成2mg/g的浓度,点滴于玉米螟幼虫体壁,处理不同时间后取对照和经苯巴比妥钠处理的玉米螟幼虫解剖,分别测定体壁、中肠、脂肪体的P450和b5含量。结果表明苯巴比妥钠对P450酶系中不同的组分具有不同的诱导作用,表现出复杂的诱导机制。苯巴比妥钠能够诱导细胞色素P450的含量,但是对细胞色素b5没有明显的诱导作用。同时,对细胞色素P450的诱导表现出不同的效应,表现为:不同的组织诱导效应不同;不同的时间诱导效应不同。这可能与苯巴比妥钠在幼虫体内的运转、积累以及P450的表达过程需要的时间不同有关。