防治奶牛乳房炎重组质粒p215C3LYZ的环境释放试验

作     者：翁玉根 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙怀昌

授予年度：2008年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：奶牛乳房炎 质粒p215C3LYZ 环境释放试验 

摘      要：奶牛乳房炎是是一种复杂的、导致奶牛业经济损失最严重的疾病之一。目前普遍使用抗生素治疗奶牛乳房炎,但抗生素存在易产生耐药性、药物残留、难以根治等缺陷,特别是“无抗奶的要求,极大地限制了抗生素应用。因此,开发高效、广谱、低毒、无残留的防治奶牛乳房炎新药成为研究热点。本实验室将溶菌酶的广谱溶菌作用与基因治疗原理相结合,构建表达人溶菌酶(hLYZ)基因的乳腺特异表达载体p215C3LYZ和真核表达重组载体pCDNAKLYZ,用来治疗和预防奶牛乳房炎。经动物转基因和乳腺暂态表达试验证明,重组载体能在乳腺细胞中表达有活性的重组hLYZ,对金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等奶牛乳腺炎常见致病菌具有明显的抑制作用。经初步临床试验证实,该基因药物对奶牛乳腺炎的防治具有疗效确切、无有害残留等优点。本次环境释放试验在开放系统中进行基因药物的研究、生产和应用,以进一步证实其临床使用安全性。将卡那霉素抗性(KanR)基因克隆入原核表达载体pQE-31,构建重组质粒pQE-Kan;经IPTG诱导成功表达了预期大小的Kan抗性蛋白;用纯化的重组蛋白免疫小鼠,获得了Kan抗性蛋白抗血清;分别用重组质粒pQE-Kan和p215C3LYZ转染COS-1细胞,将转染细胞上清分为添加和不加Kan组,接种DH5a大肠杆菌,培养物的OD600检测结果显示,添加Kan组的DH5a大肠杆菌生长被抑制,转染细胞上清中无Kan抗性蛋白表达;以Kan抗性蛋白免疫血清进行的Western blotting结果显示,转染细胞内无Kan抗性蛋白表达;将p215C3LYZ注射奶牛乳腺,用脱脂和浓缩奶样进行Western blotting检测,结果显示试验牛乳中也无Kan抗性蛋白表达;将质粒p215C3LYZ穿刺注射乳房基部,从血液、奶样、唾液、粪、尿样品以及空气和垫料培养物等样品中提取的DNA为模板进行PCR检测,结果显示除质粒注射后第一天奶样的检测结果为阳性外,其余时间均为阴性。这些检测结果表明,重组质粒p215C3LYZ没有向周边环境扩散,不会表达对奶牛和人体有害的Kan抗性蛋白,具有良好的生物安全性。