构建小鼠肉瘤随机表达文库筛选肿瘤新抗原

作     者：赵恢准 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：祁高富

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肿瘤基因随机表达文库 小鼠肉瘤S180 肿瘤抗原 PCMT1 体液免疫应答 

摘      要：肿瘤疫苗可激发机体产生针对肿瘤的特异性免疫应答,是常见的免疫疗法,而肿瘤抗原又是研制有效的肿瘤疫苗的基础。因此,创造和发现新的肿瘤抗原,有利于克服免疫耐受和免疫抑制,研制更为有效的新型抗肿瘤疫苗。本研究以小鼠S180肉瘤为例,尝试通过构建肿瘤基因随机表达文库的新方法来创造和筛选新型的肿瘤抗原。(1)小鼠S180肉瘤基因随机表达文库的构建。提取S180肉瘤组织总RNA,反转录成c DNA,用10条随机引物从c DNA中扩增得到大量随机大小的基因片段M,通过双酶切位点Eco R I和Hind III将这些基因片段插入到表达载体p ET-28a-HSP的HSP65的C末端,然后转化大肠杆菌,从而构建小鼠S180肉瘤基因随机表达文库。(2)从S180肉瘤基因随机表达文库中筛选具有抗肿瘤活性的转化子。经过多次转化和抗性筛选,得到537个阳性转化子组成的肿瘤随机表达文库。将库中各转化子培养,IPTG诱导表达后对菌体全蛋白进行SDS-PAGE分析筛选,得到100个表达分子量大于65 k Da融合蛋白的转化子。通过3次菌液免疫抑瘤效果的筛选,获得免疫抗瘤效果最佳的转化子A5菌株,其菌液免疫抑瘤率为79.15±1.74%。(3)重组蛋白免疫抗瘤效果的验证。菌株A5能够表达分子量为81 k Da的融合蛋白HSP-A5,构建的含表达质粒p ET-28a-A5的工程菌株能够表达分子量为16k Da的蛋白A5。纯化得到重组融合蛋白HSP-A5和A5,进行免疫抗瘤效果验证,结果显示蛋白HSP-A5和A5的免疫抑瘤率分别为62.40±1.91%和58.74±0.91%,显著高于PBS对照组(p0.01)或HSP65对照组(p0.01)。(4)重组蛋白的免疫机制研究。重组蛋白HSP-A5和A5免疫小鼠之后,收集小鼠血清,ELISA检测小鼠血清中Ig G效价,结果显示HSP-A5免疫小鼠血清中抗HSP-A5的Ig G抗体效价为25,600×,抗A5的Ig G抗体效价为3,200×,而A5免疫小鼠血清中抗A5的Ig G抗体效价为1,600×。蛋白HSP-A5和A5均能激发小鼠机体产生高效价的A5抗体,从而抑制S180肉瘤的生长。进一步以HSP-A5抗血清过继免疫治疗,其对S180的抑瘤率为34.67±1.23%,与阳性对照紫杉醇36.73±1.18%的抑瘤效果相当。这一数据验证了A5特异性抗体在抗S180肉瘤的过程中起了重要的作用。为了验证蛋白HSP-A5和A5能否激发机体产生特异性的细胞免疫反应发挥免疫抗瘤效果,分别检测了T淋巴细胞胞内Th1型细胞因子TNF-α和IFN-γ的表达,同时检测了细胞毒T淋巴细胞杀伤活性和抗原A5特异性淋巴细胞的增殖效应,结果发现蛋白HSP-A5和A5无法有效激发小鼠体内产生针对S180肉瘤的细胞免疫应答。(5)A5诱导抗体的靶标为PCMT1。蛋白A5含有一段与L-异天冬氨酸(D-天冬氨酸)-O-甲基转移酶(PCMT1)相似的氨基酸残基序列。大肠杆菌表达并纯化PCMT1(32 k Da)蛋白,然后进行Western Blotting、ADCC及CDC效应的检测。结果表明,蛋白A5和PCMT1诱导的抗体都能够同时与A5和PCMT1特异性结合,也都能够诱导针对S180细胞的ADCC和CDC作用。进一步通过免疫荧光测定,发现A5和PCMT1诱导产生的抗体,都能特异性结合于S180肉瘤细胞的表面,表明S180肉瘤细胞表面表达有PCMT1蛋白或其提呈的PCMT1表位肽,也解释了这两个抗体诱导产生ADCC效应和CDC效应的机制。以上结果,验证了PCMT1是A5蛋白抗肿瘤疫苗新的靶标与位点。综上所述,通过构建肿瘤基因随机表达文库,可以创造和筛选新的肿瘤抗原,发现新的肿瘤免疫治疗的靶点,为肿瘤疫苗的研发提供一种新的策略与方法。运用该方法,我们成功创造和获得了A5抗原,发现其诱导产生的抗体可以与S180肉瘤细胞表面新的作用靶点PCMT1结合,从而可以通过ADCC和CDC等作用,发挥其免疫抗瘤效果。