荧光假单胞菌FD6抗生素合成调控基因的克隆及功能分析

作     者：肖琦 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张清霞

授予年度：2015年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：荧光假单胞菌 抗生素 Gac/Rsm RetS Vfr 调控因子 

摘      要：荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) FD6分离自福建省闽侯青口青菜根围,对番茄灰霉病和桃褐腐病具有较好的防病效果。该菌株可以产生多种抑菌物质,如抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG, PHL)、硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin, PRN)和藤黄绿脓菌素(Pyoluterrin, PLT)等。前期的研究已证实这三种抗生素的生物合成受到GacS因子的正调控。RetS (Regulator of exopolysaccharide and type III secretion)是位于细胞膜上的感应激酶,对多种基因的表达都有调控作用。本研究通过PCR法克隆得到FD6菌株中3767 bp的retS基因片段,利用同源重组进行基因缺失,通过功能互补分析retS基因对FD6生防相关性状的影响。结果表明,retS基因缺失后抗生素PRN.2,4-DAPG和PLT的产量比野生型菌株FD6显著升高,分别是野生菌FD6的8.4倍、1.5倍和1.3倍,说明retS负调控抗生素PRN、2,4-DAPG和PLT生物合成。同时,retS基因在转录水平负调控prnA、phlA和pltA基因的转录。本研究还发现retS基因在转录水平负调控小RNA rsmX、rsmY和rsmZ的转录表达。在retS基因和gacS基因双缺失突变菌株中,抗生素PRN、2,4-DAPG和PLT合成量降低、小RNA转录表达及对病原真菌拮抗能力等性状也降低,且与gacS基因单缺失突变体的表型相似,说明retS基因对抗生素PRN、2,4-DAPG和PLT生物合成的调控依赖于Gac/Rsm信号传导途径中的GacS蛋白。此外,还影响菌株FD6生长、游动性、生物膜的形成和定殖能力。以上结果表明,retS是影响FD6菌株生防能力的一个重要因子。通过PCR法还克隆得到FD6菌株中2496 bp的vfr (Virulence factor regulator)基因,同样方法构建vfr基囚内缺失突变菌株FD6Avfr和互补菌株FD6-vfr,分析vfr基因对FD6生防相关性状的影响。结果表明,vfr基因缺失后抗生素PRN、2,4-DAPG和PLT的合成量都显著升高,分别是野生型菌株FD6的2.2倍、2.8倍和2.2倍,说明vfr基因也是抗生素生物合成的负调控因子。为了进一步探索vfr基因可能的调控机制,检测了vfr基因在转录水平的影响,实验结果表明,vfr基因对抗生素的调控不依赖于Gac/Rsm,但明显抑制rsmA、fleQ和rpoS的表达。同时,vfr基因在转录水平负调控prnA、phlA和pltA基因的转录。此外,vfr基因还影响菌株FD6生长、游动性、蛋白酶、生物膜的形成和定殖能力。以上结果表明,vfr是影响FD6菌株生防能力的一个重要因子。