猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制及猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定

作     者：黄少梅 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹胜波;董晓辉

授予年度：2013年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：乙型脑炎 猪乙型脑炎病毒 ELISA 基因型 进化树 

摘      要：乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE,简称乙脑)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的急性自然疫源性虫媒传播的人畜共患传染病。JEV可引起成年母猪和公猪的繁殖障碍以及新生仔猪脑炎等,同时还能够感染人群。JEV的感染呈猪-蚊-人链状传播,而猪是JEV最重要的宿主。监测和预防猪乙脑的发生对于人乙脑的预防和控制具有重要意义。因此,建立快速准确的诊断方法与安全有效的疫苗是预防和控制该病的前提。本研究围绕猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制和猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定两个方面展开,具体内容如下： 1.猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的研制 用灭活纯化的JEV SA14-14-2株包被酶标板,通过方阵滴定法确定抗原的最佳包被浓度为0.2μg/孔,被检血清最佳稀释倍数为1：40。试验的最佳反应条件为：包被液为pH值9.6的0.05mol/L碳酸盐缓冲液,封闭液为含0.5%牛血清白蛋白、0.5%吐温20的磷酸盐缓冲液,抗原与血清结合的最佳反应时间为30min,二抗的最佳稀释倍数为1：5000,羊抗猪酶标二抗的最佳反应时间为30min,底物的最佳反应时间为10min。 用该试剂盒检测猪口蹄疫、猪瘟、猪2型圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病、猪伪狂犬病等阳性血清,结果均为阴性,证明该试剂盒特异性良好,用质控阳性血清对本试剂盒进行敏感性检测,均能符合要求,批内重复变异系数为0.78%～6.54%,批间重复变异系数为1.29%-10.85%。保质期试验结果表明,该试剂盒可在2-8℃保存10个月。与猪乙型脑炎病毒乳胶凝集试验抗体检测试剂盒比较,其总符合率为87.9%。 2.猪源乙型脑炎病毒的分离鉴定 2012年9月从广西南宁某猪场采集了疑似乙脑病毒感染的猪脑组织样品,通过RT-PCR检测到1份乙脑阳性病料。将该病料接种BHK-21细胞进行病毒的分离,通过全基因组测序分析,结果分离到一株乙脑病毒,命名为GX1209。该毒株的核苷酸长度为10965bp, GC含量为53.5%。系统进化树分析该毒株属基因Ⅰ型,与XJ69株的核苷酸和氨基酸同源性最高都为99%。与SA14、SA14-14-2、P3的氨基酸同源性分别为98%、97%、98%。与广西分离到的其他乙脑病毒毒株BL06-50、 BL06-54、GX0523/44、GX0519,其氨基酸同源性都为99%。昆明乳鼠脑内接种方法增殖该毒株,采用蚀斑形成单位(PFU)测定病毒滴度为1×107PFU/mL。