上皮-间质转化与胆管癌肿瘤耐药性的相关性研究

作     者：范帅 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张炳远

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：EMT 肿瘤耐药性 胆管癌 PI3K/Akt 

摘      要：目的研究上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)与胆管癌肿瘤耐药机制之间的相关性联系。方法利用PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002逆转EMT重要通路PI3K/Akt,以人胆管癌QBC939细胞株(QBC939/WT)和耐5-氟尿嘧啶(5-FU)人胆管癌QBC939细胞株(QBC939/5-FU)为模型进行体外实验。第一部分:对QBC939/WT和QBC939/5-FU两株细胞进行药敏性检测,比较其差异;倒置显微镜下观察两株细胞形态,分析其差异;通过RT-PCR、Western blot实验检测两株细胞EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等mRNA和蛋白表达水平;利用细胞划痕实验和Transwell实验比较两株细胞的迁移能力;CCK8实验比较两株细胞的增殖能力。第二部分,在QBC939/5-FU细胞添加PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002后,检测QBC939/5-FU(LY294002)与QBC939/5-FU组的药物敏感性差异;显微镜下观察QBC939/5-FU(LY294002)细胞形态学变化;通过RT-PCR、Western blot实验检测两株细胞EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等mRNA和蛋白表达情况;细胞划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移能力;CCK8实验检测细胞的增殖能力;并与QBC939/5-FU结果进行比较。结果第一部分:QBC939/WT和QBC939/5-FU对5-FU IC分别为37.42±0.25μmol·L和83.78±3.54μmol·L,差异具有统计学意义(P0.05);倒置显微镜观察显示QBC939/5-FU与QBC939/WT相比细胞由紧密连接的铺路石状变为表面多突起的梭形,且细胞之间距离疏远;RT-PCR、Western blot实验结果显示:QBC939/5-FU上皮细胞特异标志物E-cadherin表达明显下调,间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin表达明显上调;QBC939/5-FU细胞迁移能力明显强于QBC939/WT细胞,差异具有统计学意义(P0.05)。QBC939/5-FU细胞较QBC939/WT细胞增殖能力明显增强,相同细胞数目培养48h、72h、96h后,前者增殖能力分别是后者的1.87±0.10倍、1.65±0.09倍、1.95±0.11倍,差异均具有统计学意义(P0.05)。第二部分:添加PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后,细胞出现明显EMT逆转表现,由梭形转变为铺路石样,细胞间距缩短、连接紧密;RT-PCR、Western blot实验结果显示:添加PI3K/Akt通路抑制剂LY294002后,上皮细胞标志物E-cadherin呈现高表达,而间质细胞标志物N-cadherin、Vimentin表达下降趋势明显;QBC939/5-FU(LY294002)对5-FU耐药性IC下降至42.52±0.57μmol·L,与QBC939/5-FU细胞比较,差异具有统计学意义(P0.05);细胞迁移能力明显减弱,与QBC939/5-FU相比,差异具有统计学意义(P0.05);而QBC939/5-FU(LY294002)细胞增殖能力呈下降趋势,与QBC939/5-FU相比增殖能力分别下降至原来的0.72±0.03倍、0.45±0.05倍、0.35±0.04倍,差异具有统计学意义(P0.05)。结论EMT的发生可增强胆管癌细胞的耐药性,且可明显增加其恶性程度;而逆转EMT发生,可以使胆管癌细胞对化疗药物的敏感性增强,耐药性降低。