EGF刺激前后MDA-MB-468细胞核磷酸化蛋白质组学分析

作     者：郭丹 

作者单位：中国科学院北京基因组研究所 

学位级别：硕士

导师姓名：刘斯奇

授予年度：2012年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071009[理学-细胞生物学] 

主      题：EGFR 细胞核 磷酸化 蛋白质组 

摘      要：表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体。研究表明,在EGF刺激条件下,EGFR可以发生核转位现象,并可能通过磷酸化其底物进一步调控基因表达及其相应的生物学功能。然而,人们对于EGFR核转位所引发的细胞核内广泛磷酸化响应尚缺乏了解。本研究以人乳腺癌细胞系MDA-MB-468为靶标,采用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术,对EGF刺激MDA-MB-468前后的细胞核磷酸化蛋白质组学进行了初步分析。我们首先测试了在不同刺激时间内,EGF是否引起MDA-MB-468细胞核内发生明显的EGFR核转位。我们观察到,EGF对MDA-MB-468的刺激时间以15min为最适。在EGF最适刺激发生后,我们采用差速离心法制备细胞核,之后提取核蛋白并用胰蛋白酶进行消化,最后使用iTRAQ试剂对消化后的肽段进行标记。我们利用Ti02亲和技术富集细胞核内的磷酸化肽段,然后运用高精度质谱仪(TripleTOF 5600)分析鉴定肽段,并进一步采用Scaffold及Scaffold PTM软件对质谱信号进行了肽段搜索和蛋白质定量。Scaffold定性分析结果表明,在MDA-MB-468细胞核中共鉴定到了275个蛋白,其中磷酸化蛋白为242个,对应336个磷酸化肽段和405个磷酸化位点。Scaffold定量分析表明,EGF刺激后可引起87个磷酸化蛋白质(包含114个差异磷酸化肽段和137个差异磷酸化位点)呈显著的丰度变化。细胞器定位分析表明,在87个差异磷酸化蛋白中,有63个定位于细胞核,其中42个蛋白上游激酶为MAPK, GSK, PKC等,它们一般受胞浆EGFR信号的激活;有两个蛋白,KHDRBS1和TNKS1BP1可能是核内EGFR的间接底物;另外19个蛋白的上游激酶并不明确。据此我们推测,这些蛋白有可能是核转位EGFR的下游调控分子,对其进行深入研究将为探索核转位EGFR的分子调控机制提供重要线索。