茶氨酸合成相关酶基因的克隆与“新高”梨增殖体系的建立

作     者：陆玲丽 

作者单位：安徽农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙俊

授予年度：2011年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：茶氨酸 3’-RACE 反向 PCR ‘新高’梨 

摘      要：茶氨酸（又称N-乙基-γ-L-谷氨酰胺，简称Theanine）是茶中特有的氨基酸，不仅影响着茶的滋味，而且还具有重要的生物活性，如降血压、抗癌、增强抗肿瘤药物的疗效、保护神经、镇静安神、提高学习和记忆能力和抗疲劳的功效。本试验克隆了茶氨酸合成相关的酶基因，同时建立了“新高梨的增殖体系，为人工培育茶氨酸梨提供研究基础。 1、本试验利用cDNA末端快速扩增技术扩增茶氨酸合成相关酶基因的3’端，设定了如下扩增体系：模板cDNA100ng，10×Buffer(Mg2+p lus)5μl，2.5mmol/L dNTPs8μl，10μmol/L特异性引物GSP47-1（第二轮为GSP47-2）1μl、10μmol/L接头引物UPM （第二轮为NUP）1μl，L ATaq DNA聚合酶2.5U，总体积50μl。扩增程序为：94℃3min;94℃30s;70℃45s;72℃80s，14个循环，-0.5℃/cycle;94℃30s;63℃45s;72℃80s，25个循环;72℃延伸10min。在此基础上克隆出长度约为2.4kb的序列。将该序列与GenBank上已知序列比对，发现与葡萄的谷氨酸氨连接酶的核苷酸序列的相似度达81%。 2、反向PCR技术（IPCR）是对已知序列DNA的两侧未知序列进行扩增和研究的方法。本试验应用IPCR方法克隆茶氨酸合成相关酶基因的启动子序列：即20μl反应液中包含1μg模板、5U限制性内切酶Bsp1407，2μl10×T buffer，2μl0.1%BSA;酶切产物环化自连体系：50μl体系中0.5μg单酶切基因组DNA，5μl10×T4连接缓冲液、5U T4DNA连接酶，22℃连接过夜;IPCR反应体系：50μl体系中约50ng环化自连接产物、2.5μl10×PCR Buffer、25mmol/L Mg2+5μl、10mmol/L dNTPs1μl，10μmol/L引物对(第一轮1S1-1S2，第二轮2S1-2S2)各2ul、1U Taq聚合酶。IPCR扩增程式为：94℃3min，94℃l min，56℃1min，72℃1min，循环29次;72℃延伸7min。利用建立的IPCR技术克隆出茶氨酸合成酶基因5’上游长度为171bp的启动子序列，且该序列含有TATA-box，该元件对基因转录的正确起始起着重要的作用。 3、本试验以‘新高’梨芽为外植体，研究了不同浓度植物生长调节剂对其离体增殖的影响。结果表明适宜‘新高’梨离体增殖的培养基为1/2MS+6-BA0.5mg.L-1+IBA0.2mg.L-1+GA30.5mg.L-1，在此培养基上平均增殖系数达到3.3。