抗赭曲霉毒素A单克隆抗体的制备及初步应用

作     者：侯霄煜 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：赵丽;黄涛

授予年度：2010年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：赭曲霉毒素A 单克隆抗体 细胞融合 酶联免疫吸附试验 加标回收率 检出率 超标率 

摘      要：目的制备抗赭曲霉毒素A（ochratoxin A, OA）的单克隆抗体（monoclonal antibody, McAb）并对其进行初步鉴定,在此基础上建立竞争抑制酶联免疫吸附试验（competitive inhibition enzyme linked immunosorbent assay, ci-ELISA）用于OA的检测。优化小米和玉米中OA的提取方法,应用建立的ci-ELISA检测济南市五个区的集市和超市出售的小米和玉米样品中OA的含量,初步了解污染情况。 方法采用小剂量长周期的免疫方案,OA-牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）偶联物免疫雌性BALB/c小鼠,分别以OA-BSA. BSA为包被抗原,用酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测小鼠血清中抗体的效价,观察该McAb与BSA的交叉反应情况。采用细胞融合的方法,以OA-BSA作为包被抗原,同时以BSA作对照,用ELISA法检测杂交瘤细胞培养上清中的McAb,获得分泌抗OA的McAb的杂交瘤细胞株,研究该McAb与BSA的交叉反应情况,以评价McAb的特异性。以有限稀释法对特异性分泌抗OA McAb的杂交瘤细胞进行克隆化,以ci-ELISA法进一步确定McAb的特异性,腹水诱生法大量制备McAb,采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水中的McAb,以ELISA检测纯化前和纯化后腹水效价,同时以BSA作包被抗原对照,研究交叉反应情况,以OA为竞争抗原,建立ci-ELISA方法用于OA的检测。选用不同浓度甲醇和氯化钠的溶液作提取溶剂提取样品中的OA,比较不同提取溶剂的加标回收率,观察提取溶剂中甲醇和氯化钠的浓度对小米、玉米样品中OA提取效果的影响,优化OA提取方法。采集济南市市中、历下、槐荫、天桥、历城五个区的集市出售的小米和玉米、济南市区超市出售的小米和玉米各50份,用所建立的ci-ELISA,采用标准加入法,对这些小米、玉米样品中OA含量进行了检测,计算检出率,并依照《中国国家标准GB2715—2005（粮食卫生标准）》中对谷类、豆类的OA的限量要求,计算超标率。所有数据均经SPSS软件包处理。 结果OA-BSA免疫的BALB/c小鼠血清抗体效价为1：512000,与BSA有强烈的交叉反应。细胞融合后,ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞株,抗OA-BSA的McAb与BSA的交叉反应率仅为3.50%,对分泌抗OA-BAS特异的McAb的细胞株经3轮克隆化,抗体分泌阳性率达到100%,建立了1株能稳定分泌抗OA-BSAMcAb的杂交瘤细胞株,ci-ELISA进一步证明了该抗体是特异针对OA的。腹水诱生法制备了大量的McAb,纯化后腹水抗体效价为1：512000,而且与BSA无交叉反应。ci-ELISA线性范围为0.04ng／***／ml,标准曲线的线性方程y=-0.1368x+0.6796,相关系数r=0.9965,检测下限为0.04ng／ml。当提取溶剂中甲醇含量为60%且含有5%氯化钠时对OA的提取效果较为理想,OA加标量为***／g、***／g、12.50ng／g时,以该提取溶剂进行确证实验,小米各加标量的平均回收率（%）分别为93.52%、96.86%、95.66%;变异系数（CV%）分别为4.59%、8.42%、8.94%,平均7.32%;玉米各加标量的平均回收率分别为96.30%、98.67%、98.13%,变异系数（CV%）分别为5.74%、5.59%、9.56%,平均6.96%。用于检测小米中OA的ci-ELISA工作曲线线性方程为y=-0.3249x+1.079,相关系数r=0.9959,用于检测玉米中OA的ci-ELISA工作曲线线性方程为y=-0.2554x+0.9561,相关系数r=0.9971。小米、玉米OA检测下限均为0.04ng／ml,OA最低限出量均为0.2ng／g。采集的所有样品中,小米OA检出率为41%（41／100）,玉米OA的检出率为38%（38／100）,二者无显著性差异（P0.05）,其中,集市小米OA的检出率为26%（13／50）,集市玉米OA检出率为32%（16／50）,二者无显著性差异（P0.05）;超市小米OA检出率为56%（28／50）,超市玉米OA检出率为44%（22／50）,二者无显著性差异（P0.05）;检测的所有小米样品中,超市小米OA检出率（56%）明显高于集市小米（26%）（P0.05）;检测的所有玉米样品中,超市玉米（44%）和集市玉米（32%）OA检出率无显著性差异（P0.05）。采集的所有样品中,小米（0.40-4.45ug/kg,中位数为