窄冠黑白杨杂种优势的MSAP和cDNA-AFLP的研究

作     者：姚培娟 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李际红

授予年度：2014年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：窄冠黑白杨 杂种优势 MSAP cDNA-AFLP 

摘      要：为了推动平原农区林业的发展，科研团队从20世纪70年代，就开始致力于窄冠型杨树的杂交育种工作，先后选育出了适合农田林网的四大类窄冠型杨树系列，分别为窄冠白杨（五个无性系）、窄冠黑青杨（四个无性系）、窄冠黑杨（五个无性系）及窄冠黑白杨，其中窄冠黑白杨的窄冠型尤为突出。为了解释窄冠黑白杨窄冠型杂种优势形成的分子机理，以便更好地利用窄冠黑白杨的杂种优势。本实验利用MSAP和cDNA-AFLP技术从表观遗传学和遗传学两方面研究窄冠黑白杨的杂种优势，揭示杂种窄冠黑白杨杂种优势的形成机理，探索窄冠黑白杨及其亲本在其DNA甲基化及核酸层面与杂种优势之间的关系。研究结果如下： 1、本实验采用MSAP技术，构建了窄冠黑白杨及其亲本的MSAP扩增图谱，从105对MSAP选扩增引物中筛选出46对扩增图谱清晰、甲基化多态性丰富、条带重复性好的选扩引物组合，共扩增获得1747条清晰可辨且可重复的DNA条带。获得了杂种窄冠黑白杨基因组DNA甲基化水平为35.31%，全甲基化水平为24.47%;半甲基化水平为10.65%;母本美洲黑杨I-69/55基因组DNA甲基化水平为39.89%，全甲基化水平为24.63%;半甲基化水平为15.26%;父本窄冠白杨4号基因组DNA甲基化水平为44.18%，全甲基化水平为28.10%;半甲基化水平为16.08%。比较可知杂种窄冠黑白杨的甲基化水平低于其亲本的甲基化水平，其均以内侧双链胞嘧啶甲基化发生为主。 2、统计46对选扩引物的MSAP扩增图谱的Page图获得1747个位点，其中单态性（A）位点为1078个，占总扩增位点数的61.71%;多态性（B、C、D）位点为669个，占38.29%。说明绝大部分的DNA甲基化模式均由亲本遗传给子代。多态性（B、C、D）位点中，B类去甲基化变异位点为497个，占多态位点的74.29%;C类超甲基化变异位点只有137个，占20.48%;D类发生复杂变异的甲基化变异位点有35个，占5.23%。结果显示，去甲基化变异的发生频率远远高于其他变异的发生频率。 3、对部分甲基化变异条带进行回收克隆测序，将得到的14条DNA序列进行同源性比对得到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，糖基转移酶，香豆酸辅酶等功能基因，这些基因在不同程度上与植物的生长发育相联系，表明窄冠黑白杨甲基化变异发生于全基因组范围内。 4、采用cDNA-AFLP技术，构建了窄冠黑白杨及其亲本的cDNA-AFLP扩增图谱，扩增获得761修饰位点，其中单亲沉默表达类型所占比例最高，为36.97%;亲本显性表达类型所占比例最低，为14.32%;杂种特异表达型、双亲沉默表达型、单态表达类型分别占21.42%、17.35%、17.08%。 5、利用BLASTn分析回收cDNA-AFLP图谱变异条带得到的19条DNA片段进行同源性分析，得到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，糖基转移酶家族的纤维素合酶，泛素激活酶，ARGOS-like重复序列家族蛋白等功能基因。