三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建及五个野生地理群的多样性分析
作者单位：中国海洋大学
学位级别：硕士
导师姓名：刘萍;宋协法
授予年度：2010年
摘 要：本文采用富集文库-菌落原位杂交法构建了三疣梭子蟹微卫星富集文库,分离筛选出30对扩增条带清晰稳定,多态性较高的引物,选取其中8对引物对我国由南到北五个群体(舟山、海州湾、青岛即墨会场、莱州湾、鸭绿江口)的野生三疣梭子蟹的遗传多样性进行了比较分析,对于加快育种进程,提高选择效率具有重要的意义。论文具体内容如下： 1、利用富集文库-菌落原位杂交法筛选三疣梭子蟹微卫星标记,通过固定了(AC)15和(AG)15探针的尼龙膜(Hybond N+)捕捉含有微卫星的片段,转化至大肠杆菌DH5α中,构建三疣梭子蟹微卫星富集文库。菌落原位杂交后,任意选取150个克隆进行测序,得到124条序列,其中18个克隆的核心序列重复数太少或不含有重复序列,106个含重复序列的克隆中均只含有微卫星位点,阳性克隆率为85.48%。通过重复序列筛查去除冗余部分,得到103个独立克隆序列,其中完美型43个,占41.75%;非完美型8个,占7.767%;复合型52个,占50.48%,共176个微卫星位点。利用软件共设计了105对微卫星引物,81对引物能够得到清晰的预期长度的扩增片段,56对引物表现出多态性。用30个野生三疣梭子蟹个体进行遗传信息评价,结果显示30个位点在该群体中具有较高多态性。不同的位点获得的等位基因数目从3～13个不等,共获得238个等位基因,平均每个位点获得8.0个等位基因,观测杂合度、期望杂合度及多态性信息含量值的范围分0.2222～1.0000、0.4367～0.9099和0.350～0.892,研究结果表明富集文库-菌落原位杂交法适合于大规模筛选目标物种的微卫星标记。 2、选取8对引物对三疣梭子蟹5个野生地理群体进行多样性分析,结果显示,8个位点在5个三疣梭子蟹群体的120个个体中共扩增得到72个等位基因,不同引物获得的等位基因数从6～12不等,平均每个位点获得的等位基因数目为9.0个。有效等位基因数在2.9058～7.7901之间,平均每个位点检测的有效等位基因数目为5.4677个。 3、计算各位点的多态信息含量,8个位点在5个群体中得到的多态信息含量有所不同,其中位点PTR112在HZ群体中获得的多态信息含量最高为0.8349,而位点PTR103b在HZ群体中的多态信息含量最低为0.3794。统计各位点在各群体中的PIC值发现,只有两个PIC值低于0.5,属于中度多态性位点,其他PIC值均大于0.5。从8个位点在每个群体中的平均多态信息含量来看,PIC值从0.6748～0.7138不等,均大于0.5;从各微卫星位点的平均多态信息含量来看,PIC值在0.5394～0.8003之间,同样都大于0.5,平均多态信息含量为0.6967。由此可见,所选择的微卫星位点具有丰富的多态性,能够在分子水平上很好的反映5个地理群体间和群体内的遗传关系。 4、8个位点在5个群体中所反映的群体杂合度有较大差异,其中位点PTR45在LZ群体的观测杂合度最高为0.9167,位点PTR103b在HZ群体的观测杂合度最低为0.4091。在某一个群体中的各位点的观测杂合度也差异较大,表明用单个位点进行群体杂合度的检测,其结果并不一定能够代表群体的真实杂合度水平,通常取多个位点杂合度的平均值。根据所得的杂合度平均值可知,5个群体的平均期望杂合度相差不大,以LZ群体的最高He=0.7704,ZS群体的杂合度最低He=0.7283;平均观测杂合度在0.6481～0.7604之间。观察5个群体的观测杂合度和期望杂合度发现,二者均相差较小,说明每个群体内的等位基因频率都未偏离HW平衡。通过对5个群体中各位点的卡方检验可知,除了LZ群体和HC群体的PTR145位点,HZ群体的PTR98a和PTR112位点以及ZS群体的PTR98a和PTR103b位点表现为显著和极显著偏离HW平衡外,其余位点均符合HW平衡。 5、通过计算种群间的遗传距离和遗传相似性指数表明,三疣梭子蟹5个群体间的遗传距离在0.2451～0.5179之间,遗传相似性指数从0.5958～0.7826,其中HC和HZ的遗传距离最小,相似性最高,LZ和ZS的遗传距离最远,相似性最小。同时该结果也反映在UPGMA聚类树上,HC和HZ两个群体遗传距离最近先聚到一起,LZ群体与这4个群体的遗传距离较远,最后聚在一起。 6、Fst值可以用来测量群体间的遗传分化程度,8个位点的遗传分化指数在0.0548～0.1083之间。从值Fst值的大小可以看出,5个群体间产生了中等程度的遗传分化(0.05
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