氨基甾体H42649对K562和CML白血病细胞的作用及其机理探讨

作     者：张君 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何群

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：氨基甾体 K562细胞系 CML原代细胞 钙通道 bcr/abl融合基因 

摘      要：目的:观察氨基甾体H42649对人慢性粒细胞白血病K562细胞系和人慢性粒细胞白血病(CML)原代细胞的抑制增殖和诱导分化作用,并进一步探讨其作用机制。 方法:采用液体培养实验,MTT实验,集落培养实验观察H42649对K562细胞和CML原代细胞的增殖能力的影响;采用Wright-Giemsa染色,联苯胺染色,氯化硝基四氮唑蓝(NBT)染色和流式细胞术观察K562细胞和CML原代细胞功能变化,评价H42649对K562细胞和CML原代细胞的诱导分化作用;通过荧光分光光度计检测H42649作用于K562细胞和CML原代细胞30min后细胞内游离钙离子浓度的变化;通过Real-time PCR检测H42649对K562细胞和CML原代细胞钙通道蛋白mRNA的表达的影响;通过Real-time PCR检测H42649对K562细胞和CML原代细胞bcr/abl融合基因mRNA的表达的影响。 结果: 1.氨基甾体H42649对K562细胞和CML原代细胞增殖的影响。 在连续培养的1～5d,不同浓度的H42649(10～10mol/L)可以抑制K562细胞细胞和CML原代细胞增殖。经10mol/L H42649培养5d,MTT实验显示K562细胞生长抑制率为(55.26±2.54)%,CML原代细胞生长抑制率分别为(63.53±2.36)%,且这种抑制作用呈一定的剂量依赖关系。 2.氨基甾体H42649对K562细胞和CML原代细胞分化的影响。 K562细胞和CML原代细胞培养5d后,Wright-Giemsa染色,光镜下与对照组比较经H42649处理后的细胞均可见体积变大,核浆比例减少,表现一定程度的分化。细胞内血红蛋白联苯胺染色显示,10mol/L H42649作用5d后,K562细胞联苯胺染色A值为(0.2701±0.1960),较对照组(0.0879±0.0645)显著升高(p0.01)。CML原代细胞NBT染色A值为(1.7539±0.0280),较对照组(1.0397±0.1731)显著升高(p0.01)。流式细胞仪分析显示,10mol/L H42649作用于K562细胞4d后,细胞膜上CD71表面标记表达阳性率为84%。作用于CML原代细胞4d后,细胞膜上CD14表面标记表达阳性率为87%。 3.氨基甾体H42649抑制K562细胞和CML原代细胞的增殖和诱导其分化作用的机制研究。 (1)氨基甾体H42649对K562细胞内和CML原代细胞内游离[Ca]的影响。 用Fura-2/AM负载K562细胞,经10mol/L H42649处理30min后,其A值为(133.0917±2.8980),与对照组(166.1050±2.3526)比较显著下降(p0.01);用Fura-2/AM负载CML原代细胞,经10-6mol/L H42649处理30min后,其A值为(126.1700±3.1968),与对照组(178.8533±5.1460)比较显著下降(p0.01)。 (2)Real-time PCR检测氨基甾体H42649作用后K562细胞和CML原代细胞钙通道蛋白mRNA的表达量变化。 分别提取对照组(无水乙醇处理)和试验组(10mol/L H42649处理)细胞的mRNA,反转录成cDNA,使用实时定量PCR法进行相对定量。最终得到K562细胞钙通道蛋白基因在对照组和试验组的相对含量(以内参校正后得值)分别是:2.05×10(对照组)和5.94×10(试验组),试验组/对照组=2.90;CML原代细胞钙通道蛋白基因在对照组和试验组的相对含量(以内参校正后得值)分别是:3.48×10(对照组)和5.94×10(试验组),试验组/对照组=1.70。即H42649处理钙通道蛋白mRNA的表达上调。 (3)Real-time PCR检测氨基甾体H42649作用后K562细胞和CML原代细胞bcr/abl融合基因mRNA的表达量变化。 分别提取对照组(无水乙醇处理)和试验组(10mol/L H42649处理)细胞bcr/abl融合基因的mRNA,反转录成cDNA,使用实时定量PCR法进行相对定量。最终得到K562细胞bcr/abl基因在对照组和试验组的相对含量(以内参校正后得值)分别是:5.30×10(对照组)和2.13×10(试验组),试验组/对照组=0.40;CML原代细胞bcr/abl基因在对照组和试验组的相对含量(以内参校正后得值)分别是:6.42×10(对照组)和2.37×10(试验组),试验组/对照组=0.37。即H42649处理bcr/abl mRNA的表达下调。 结论: 1.氨基甾体H42649能显著抑制K562细胞和CML原代细胞的增殖,并呈一定的剂量依赖关系。 2.氨基甾体H42649具有诱导K562细