香蕉成熟相关基因的克隆及表达的定量分析

作     者：张德有 

作者单位：华南热带农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：金志强

授予年度：2002年

学科分类：09[农学] 0902[农学-园艺学] 090201[农学-果树学] 

主      题：香蕉 凝集素(Lectin)基因 果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因 定量PCR 竞争性PCR 

摘      要：本研究通过RT-PCR和PCR扩增的方法，从巴西香蕉(Musa Acuminata ***.)果实中扩增得到四条片段——香蕉凝集素(Lectin)基因cDNA片段和DNA片段、香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因cDNA片段和DNA片段。分别将它们与pGEM-T Easy Vector连接，转化*** DH5α，得到重组子，经酶切鉴定和PCR鉴定后，进行了序列的测定。通过序列分析得知，香蕉凝集素(Lectin)基因cDNA片段长508 bp;香蕉凝集素(Lectin)基因DNA片段长575bp，有一个长为67bp的内含子;香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因cDNA片段长1，316bp;香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因DNA片段长1，858bp，有三个内含子区，分别长90 bp，83 bp和370bp;在总共的四个内含子序列中，分别都符合GT-AG规则。此四条片段的核苷酸序列分别与GenBank中发表的Lectin基因(AF001527)及Pectate Lyase基因(X92943)具有95％以上的同源性。同时，香蕉凝集素(Lectin)基因的cDNA片段和DNA片段所推测出的氨基酸序列与GenBank中发表的Lectin基因(AF001527)的氨基酸序列也具有93％以上的同源性。 本研究还用RT-PCR的方法对香蕉凝集素(Lectin)基因和香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因在香蕉不同组织和果实采后不同成熟阶段的表达情况进行了研究。分别提取香蕉根、叶、及不同成熟阶段果皮和果肉共12个组织的Total RNA，通过RT-PCR，结果发现香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因在四个组织阶段中特异表达，分别是：成熟度4、5的果皮和成熟度3、4的果肉组织;香蕉凝集素(Lectin)基因在七个组织阶段特异表达。分别是：成熟度2、3、4的果皮和成熟度2、3、4、5的果肉组织。证明这两个基因都具有组织特异性，都在果实特定的成熟阶段表达，并且在果皮和果肉中表达的成熟阶段也不一样。 在这两个基因表达的定性研究之后，还对这两个基因的表达进行了定量研究。 首先通过定量PCR方法研究香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因的表达情况。发现香蕉果胶裂解酶(Pectate Lyase)基因在四个组织中的表达强度依次为：成熟度4果肉成熟度3果肉成熟度5果皮成熟度4果皮。 其后通过竞争性PCR技术对香蕉凝集素(Lectin)基因的表达情况进行相对定量研究。结果显示成熟度2的果皮组织中，每微克Total RNA含有0.012，665 张惋有：晋唬地硫书共总困的记险及取这的灭骨方折 ng转录本;成熟度3的果皮组织中，每微克Total RNA含有0刀19，149 un转录 本;成熟度4的果皮组织中，每微克Total RNA含有 0．001，564 ng转录本;成 熟度2的果肉组织中，每微克Total RNA含有＊739，199 ng转录本;成熟度3 的果肉组织中，每微克Total RNA含有又963，732 ng转录本;成熟度 4的果肉 组织中，每微克 TOtal RNA含有 4．879，877 ng转录本;成熟度 5的果肉组织中， 每微克 TOtal RNA含有 3．584，009 ng转录本。 参照相关研究的结果，关于应用PCR技术，特别是关于应用竞争性PCR 技术来检测基因的表达情况，进行了讨论。 最后，将香蕉凝集素儿ect士）基因的DNA片段登录到GenBank，登录号 （GenBank Accession Number）为：AY103481。