中华蜜蜂囊状幼虫病病毒系统发育关系与感染性克隆制备

作     者：Shahid Mehmood 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：苏松坤;黄伟峰

授予年度：2018年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：囊状幼虫病 东方蜜蜂囊状幼虫病毒 克隆病毒 双顺反子 IGR-IRES 

摘      要：囊状幼虫病毒(SBV)广泛存在于西方蜜蜂(Apis mellifera)中,而在东方蜜蜂(Apis cerana)中独特演化出一 SBV毒株,中蜂囊状幼虫病(中囊病)病毒(Apis cerana SBV,AcSBV),导致幼虫在化蛹前死亡,常使蜂群群势下降蜂群崩溃,是中蜂生产中最严重的病害,几乎所有东方蜜蜂的自然栖息地都有AcSBV存在。台湾地区中蜂在2015年之前没有相关研究报道,当地蜂农也没有被囊状幼虫病毒影响过,直到2016年台湾中部饲养中蜂的蜂农发现了 SBV类似症状。我们用RT-PCR方法检测了该地区患病蜂群蜜蜂幼虫的样本,并对台湾北部地区没有发病症状的蜂场进行了调查。系统发育分析显示,从中国台湾中部蜂群中分离的AcSBV应为外源引入;所有分离得到的AcSBV的基因序列与在中国大陆、越南和韩国的AcSBV基因组序列具有高度的相似性,但与中国台湾鉴定出的SBV序列有明显的区别。患病蜂群中的总体流行性较低,在无症状的蜂群中未发现潜伏感染,AcSBV可能尚未达到其最高的流行病潜力。囊状幼虫病毒在蜜蜂中能造成致死疾病,它属于软腐病病毒科,是一种单链正股RNA病毒,仅编码一个开放阅读框(Open reading frame,ORF),翻译成一个多聚蛋白后在宿主细胞中再进行切割成单一有功能的蛋白。目前没有反向遗传学研究数据,很难在不影响单个ORF的前提下,创建具有人为引入突变或报告基因的感染性克隆。在本研究中,我们构建了一种模拟dicistrovirus基因组结构的双顺反子中囊病病毒克隆,两个ORFs由基因间区IRES(IGR-IRES)划分。黑王台病毒的基因间区IRES在克隆后整合到中囊病病毒基因组3’-端非编码区之后,后再接上EGFP基因与polyA区。转录后,将病毒RNA注射到蜜蜂幼虫体内,产生带蛋白壳的克隆病毒,并作为经口接种源两代以上。接种后的幼虫表现出典型的中囊病病状和EGFP荧光,证明了组建的双顺反子中囊病病毒克隆是稳定的,功能与野生型中囊病相同。此外,研究结果显示,表明SBV的3’端非编码区不影响IGR-IRES的功能以及其后人为引入序列的复制。我们的SBV克隆含有易于追踪的EGFP荧光表达可以有助于更好地理解中囊病病毒的反向遗传学、致病机理以及传染机制。中囊病病毒有典型软腐病毒基因组结构,与其他软腐病毒有高度相似的基因组序列,相同的方法能适用于其他蜜蜂或昆虫的软腐病毒可隆。