骨膜蛋白对牙周膜干细胞增殖、迁移、粘附及成骨分化的影响

作     者：米雁翎 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张凡;李敏启

授予年度：2018年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100302[医学-口腔临床医学] 10[医学] 

主      题：骨膜蛋白 牙周膜干细胞 成骨分化 迁移 粘附 

摘      要：背景和目的:健康的牙周状况是正畸牙移动以及牙齿承受咬合力的保障,无论是正畸力还是生理范围内的咬合力,都会引起周期性的牙周组织改建,包括牙周膜改建和骨组织重塑等,这是一个非感染性、微创伤性的炎症反应过程。研究表明,机械力或一定程度的炎症刺激,都会引起牙周局部微环境的变化,如血流的变化以及各种炎症因子的表达变化,从而引起牙周组织的改建。超出生理范围的正畸力或者咬合力都可能引起牙周组织一过性甚至不可逆性的损害,对于牙周炎易感患者而言,这个生理范围却相对缩小了,其牙周局部微环境的稳态更容易被破坏。牙周膜对正畸力或咬合力的吸收和分散是维持牙周稳态所必须的,研究证实,骨膜蛋白(Periostin,POSTN)在这个过程中扮演了非常重要的角色。骨膜蛋白因其特异性分布在骨膜和牙周膜而被命名,近年来研究发现骨膜蛋白在骨骼肌、心肌、肺、肌腱等富含纤维组织的器官中同样表达且起着非常重要的作用,尤其是在持续接受机械应力刺激的组织中。作为一种重要的细胞外基质蛋白,骨膜蛋白在发育个体中的表达更优于成熟个体,但在血管损伤和骨折时表达增加;在维持牙周膜的完整性方面,骨膜蛋白也起着非常重要的作用。研究指出,正畸牙移动的初始阶段,骨膜蛋白在牙周膜中的表达显著增加。在牙周组织中,骨膜蛋白主要表达在成纤维细胞、成骨细胞以及骨细胞,它参与了细胞外胶原纤维的合成,同时又可以通过与细胞表面αvβ3整合素受体结合,参与牙周组织及骨组织对机械应力的感受,促进很多细胞的迁移及粘附能力。众多研究表明骨膜蛋白在牙周组织改建过程中起着举足轻重的作用:敲除骨膜蛋白后,正畸牙齿移动速率降低,组织学观察牙齿的压力侧及张力侧正常的骨硬化素(Sclerostin,SOST)表达变化及胶原生成降解消失,同时骨膜蛋白敲除的小鼠牙周组织缺陷,生理范围内的咬合力及正畸力都极易造成牙槽骨及其他牙周组织的缺损。牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cell,PDLSCs)是牙周膜中存在的少量间充质干细胞,具有多向分化潜力及牙周再生能力,在牙周改建、牙周组织再生中具有重要作用。有研究发现,骨膜蛋白可以促进骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)的迁移、归巢及成骨分化,但骨膜蛋白对PDLSCs的影响还未见报道。根据以上发现,我们提出假设骨膜蛋白可以通过影响PDLSCs的生物学行为从而参与牙周组织改建,故我们拟通过本研究探讨POSTN对PDLSCs增殖、迁移、粘附以及成骨向分化的影响,从而深入了解骨膜蛋白参与牙周改建的机制。方法:临床上收集纳入标准的离体牙(25岁以下牙根完整的正畸拔除牙齿或者健康的阻生智齿),去除多余上皮组织和炎症肉芽组织,含5%双抗的PBS缓冲液及组织培养基交替冲洗牙周膜组织,修剪根中1/3的牙周膜组织为1mm3大小,并用镊子挑取,均匀置于培养瓶底;利用组织块法体外分离培养人牙周膜细胞,并利用高浓度血清培养基提高分离成功率和细胞存活能力。常规培养1-2周后,倒置显微镜下可观察到有细胞逐渐从组织边缘游离,细胞贴壁长满瓶底即可传代培养。选取P2和P3代牙周膜细胞分别进行单克隆筛选及干性鉴定,并选取P4或P5代牙周膜干细胞进行实验:通过给予不同浓度的人重组骨膜蛋白(recombinant human periostin,rhPOSTN),分别利用 CCK8、Transwell、细胞划痕实验、细胞粘附实验检测骨膜蛋白对牙周膜干细胞增殖、迁移及粘附能力的影响。通过对牙周膜干细胞的成骨分化诱导培养,研究骨膜蛋白对牙周膜干细胞成骨分化过程中ALP活性及矿化沉积能力的影响,同时利用qRT-PCR检测了成骨诱导7d后牙周膜干细胞中Runx2、ALP、OPN、OCN、osterix及BSP的表达变化,初步探究骨膜蛋白对牙周膜干细胞生物学行为影响的作用机制。结果:(1)牙周膜干细胞的分离培养及干性鉴定:牙周膜原代细胞在7d左右从组织块游出,2-4w爬满培养瓶,以组织块为中心呈放射状、旋涡状生长,传代后细胞生长旺盛、状态良好、性状稳定,具有一定单克隆能力,流式细胞仪鉴定细胞表面分子,验证了其间充质来源;细胞体外成骨成脂诱导后,出现明显矿化结节和脂滴。(2)CCK8实验结果显示:与对照组相比,在24h、48h、72h三个时间点检测,较低浓度如20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的rhPOSTN可以促进牙周膜干细胞的增殖,且随浓度的增加而增加,但高浓度的rhPOSTN可以抑制hPDLSCs的增殖。(3)Transwell实验、划痕实验、粘附实验:Transwell实验和划痕实验证明,与对照组相比,50ng/ml和100ng/ml的rhPOSTN能明显提高hPDLSCs的迁移能力。细胞黏附实验结果显示,骨膜蛋白可明显促进细胞的初期黏附与伸展。(4)碱性磷酸酶定量检测、茜素红染色实验和qRT-PCR结果显示:体外成骨诱导培养后,骨膜蛋白可促进牙周膜干细胞内及上清中ALP活性的表达,同时提高细胞的矿化沉积能力,qRT-PCR结果显示骨膜蛋白不同程度的提高了牙周膜干细胞中ALP、osterix、Runx2、OPN、OCN及BSP等成骨相关因子的表达。结论:(1)一定浓度的骨膜蛋白可以促进牙周膜干细胞的增殖,但是高浓度的骨膜蛋白反而抑制牙周膜干细胞的增殖。(2)在适宜浓度范围内,骨膜蛋白可以刺激牙周膜干细胞的迁移和粘附,且这种促进作用呈现浓度梯度。(3)在适宜浓度范围内,骨膜蛋白可以促进牙周膜干细胞的成骨向分化,促进ALP活性的表达、矿化沉积能力以及各成骨相关因子的表达。