产丁酸菌通过重塑肠道菌群抑制Wnt通路防治高脂饮食诱导的肠腺瘤恶变

作     者：金多晨 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王邦茂

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：产丁酸菌 短链脂肪酸 肠道菌群 肠癌 高脂饮食 Apcmin/+小鼠 

摘      要：目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的发生受机体遗传因素和环境因素的双重影响,大部分肠癌患者存在抑癌基因Apc基因的突变,进而导致Wnt通路异常活化。肠道菌群可通过多种途径影响肠癌的进展,临床研究表明肠癌患者产丁酸菌丰度以及短链脂肪酸(Short chain fatty acid,SCFA)水平均比健康人群明显降低。其中,粪便丁酸水平的降低不仅可作为肠癌风险的预测指标,而且可以反映肠癌进展程度以及严重度。丁酸具有组蛋白去乙酰化酶抑制作用,可稳定肿瘤相关miRNA簇,维持靶基因转录后表达水平。饮食因素对维持肠道菌群稳态至关重要,研究表明摄入高脂饮食人群结肠乳杆菌目丰度降低,梭菌亚群XIVa丰度增加。本研究旨在探索产丁酸菌是如何调节肠道菌群失调,进而抑制高脂饮食诱导的肠癌发生的现象及机制。方法动物实验方法:30只可自发形成肠道腺瘤的4周龄Apc小鼠分别给予产丁酸菌活菌+高脂饮食、PBS+高脂饮食及PBS+普通饮食不同处理。实验第12周时分别收集每只小鼠的新鲜粪便,收集粪便后处死小鼠,分离肝脾、小肠及结肠。将远段小肠和结肠部分行石蜡包埋,部分冻存于液氮中。细胞实验方法:采用人肠癌细胞系Caco-2和HCT116为研究对象,分别给予产丁酸菌菌液上清、丁酸钠溶液及产丁酸菌培养基处理细胞,处理条件包括不同时间梯度及浓度梯度。(1)统计各组小鼠肠腺瘤大小、数目及肿瘤负荷,各组小鼠肠腺瘤石蜡切片HE染色评价腺瘤病理分型及癌变程度;(2)各组小鼠肠腺瘤石蜡切片Ki-67免疫组织化学染色检测肿瘤细胞增殖水平,TUNEL法染色检测肿瘤细胞凋亡水平;(3)采用气相色谱法检测各组小鼠回盲部内容物各种短链脂肪酸水平,Realtime-PCR法测定各组小鼠结肠组织丁酸识别受体基因表达水平;(4)采用16S DNA高通量测序检测各组小鼠肠道菌群丰度及多样性,免疫组织化学染色法检测小鼠结肠腺瘤Wnt通路相关分子活化水平。(5)不同处理后,采用CCK-8试剂盒检测两种肠癌细胞增殖水平;(6)采用Realtime-PCR检测肠癌细胞丁酸识别受体及肿瘤相关信号分子TLR/MyD88表达情况;(7)采用Western blot法检测两种肠癌细胞肿瘤相关Wnt通路分子的蛋白表达情况。结果1、动物实验结果:(1)与单纯摄入高脂饮食的小鼠相比,产丁酸菌干预组小鼠结肠肿瘤数目明显减少,直径3mm大腺瘤比例明显减少,肠道肿瘤负荷显著减轻;(2)与单纯高脂饮食组小鼠相比,产丁酸菌干预组小鼠肠腺瘤细胞Ki-67阳性染色百分比显著降低,凋亡染色阳性细胞百分比显著升高;(3)与单纯摄入高脂饮食的小鼠相比,产丁酸菌干预组小鼠回盲部内容物中短链脂肪酸包括乙酸、丙酸、丁酸及异戊酸含量均显著提高,结肠组织中丁酸识别受体GPR43及GPR109A表达量显著增加,而GPR41表达量虽有上升,但尚无统计学意义;(4)与单纯高脂饮食组小鼠相比,产丁酸菌干预组小鼠肠道致病菌脱硫弧菌属和梭菌属丰度均显著降低,可产生丁酸的罗氏菌属、梭菌亚群XIVa、IV及XI丰度显著增加,益生菌如乳杆菌属丰度也显著增加;(5)与单纯高脂饮食组小鼠相比,产丁酸菌干预组小鼠肠腺瘤细胞β-catenin异位表达明显下降,下游靶分子cyclin D1阳性细胞比例显著降低。2、细胞实验结果:(1)与纯培养基相比,20%丁酸梭菌上清在两种肠癌细胞中存在明显生长抑制作用,丁酸梭菌的主要代谢产物丁酸对肠癌细胞表现出生长抑制作用,呈明显的浓度依赖性,时间依赖性有待进一步明确;(2)丁酸梭菌上清和丁酸钠溶液刺激后,丁酸识别受体GPR43基因表达水平分别是对照组的4.5倍和4.2倍,GPR109A基因表达水平分别是对照组的2.6倍和7.0倍,然而GPR41基因表达水平只有对照组的52.9%及33.5%;(3)TLR4基因表达水平经产丁酸菌菌液上清和丁酸钠溶液处理后分别是对照组的9.1%和17.6%,MyD88水平分别是对照组的23.3%和58.6%,菌液上清刺激后肠癌细胞cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平与对照组相比明显降低,胞核β-catenin异位蛋白表达水平明显降低。结论产丁酸菌可通过重塑肠道菌群及下调Wnt/β-catenin信号通路抑制高脂饮食诱导的肠腺瘤恶变。