基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原（PCT）试剂的研究

作     者：邵向阳 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐伟文

授予年度：2018年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：时间分辨免疫荧光技术 即时检验(POCT) 免疫层析技术 降钙素原(PCT) 脓毒血症 

摘      要：背景:感染性疾病是临床上的常见病,发病率呈逐渐上升的趋势,严重的感染患者会发生感染性休克。不同类型的感染性疾病的治疗方案也不同,细菌感染需要及时采用抗生素进行治疗,非细菌性感染则应慎用抗生素治疗。脓毒血症是一种死亡率较高的疾病,是非心脏内科ICU病人死亡的主要原因,我国估计约300万例/年,死亡率40%-50%。不能接受有效的抗生素治疗,患者的死亡风险逐渐上升,每推迟一小时,死亡率将增加7.6%。因此对这些感染性疾病进行早期的鉴别诊断,选择合适的治疗方案显得非常重要。降钙素原（procalcitonin,PCT）作为脓毒血症、炎症的一个良好血清学标志物,有助于临床感染性疾病的鉴别诊断及其预后评估,指导抗生素使用。目前PCT的检测方法主要有定量法（化学发光法、酶联免疫发光分析法）和半定量法（胶体金法）。化学发光法、酶联免疫发光分析法能准确定量,化学发光法需要大型专用仪器、费用昂贵、使用不便,酶联免疫发光分析法操作繁琐,准确性影响因素较多等缺点,限制了使用范围。胶体金法快速简便,但是不能精确的定量。PCT的动态监测和早期检测在临床上的价值意义重大,因此需要建立一种能快速、简便、准确对PCT定量的方法。目的:建立一种适用于床旁检测（Point of care testing,POCT）又称为“即时检验的快速定量检测方法以助于PCT的及时检测和动态监测。本研究采用时间分辨结合免疫层析技术,建立一种快速定量检测PCT的方法。方法:1.将购买的两对PCT特异性单克隆行标记和包被抗体配对组合,用时间分辨免疫荧光分析法（TRFIA,Time-resolved fluoroimmunoassay）进行筛选,获取最佳的标记及包被抗体。2.应用双抗体夹心法,建立基于时间分辨荧光免疫层析快速定量检测降钙素原（PCT）试剂的方法。对各项试剂参数进行优化包括:硝酸纤维膜（NC膜）的筛选、检测线（T）和质控线（C）包被抗体量、最佳的划线量、标记抗体最佳用量、最佳反应时间确定。3.对试剂性能指标评估,进行以下实验:标准曲线、分析灵敏度、准确度、精密度、特异性、临床考核实验。结果:1.通过TRFIA法,综合剂量-反应曲线相关系数（r）、信噪比、背景等,筛选最优的标记原料（MJ03）;包被原料（16B5）。2.确立基于免疫层析技术与时间分辨技术反应模式;最佳的硝酸纤维膜HF135膜;检测线（T）16B5最佳包被用量2.0mg/mL;质控线（C）山羊抗兔IgG最佳包被用量1.0mg/mL;最优划线喷速0.08μL/mm;标记抗体MJG03最佳用量为0.1mg/mL;兔IgG最佳用量为0.1mg/mL;最佳反应时间为15min。3.试剂性能指标评估:标准曲线回归方程:log（y）= 1.1143+0.8529log（x）,r=0.9994;分析灵敏度为0.08ng/mL;准确度（回收率）在93%～105%之间;分析、分析间精密度CV在5.4%～13.4%;检测样本时不受人降钙素、CRP、人抗钙素、IL-6干扰物质的影响;234例临床样本考核实验等效性对比研究表明,自制试剂盒和商品化试剂盒（Roche Elecsys BRAHMS PCT Kit）具有很好的一致性（Kappa =0.875）和相关性[r = 0.977,（P0.01）]。结论:本研究成功研制了基于时间分辨荧光免疫层析技术快速定量检测PCT的试剂,试剂各项参数、性能指标良好,均符合体外诊断试剂的要求。能很好的满足临床对PCT快速定量检测的需求。