Dravet综合征相关钠通道SCN1A基因3'非翻译区突变（c.*20A>G）的功能分析

作     者：肖旋浩 

作者单位：广州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：潘小平;曾涛

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：Dravet综合征 钠离子通道 SCN1A基因 3’非翻译区 转录后调控 GAPDH 

摘      要：研究背景和目的Dravet综合征(Dravet syndrome,DS),一种难治性癫痫性脑病,典型表现为一岁以内生长发育正常的患儿突然出现热性或无热惊厥,以全面性或单侧阵挛或强直阵挛发作起病,以后出现多种发作类型,如肌阵挛发作、不典型失神发作、复杂局灶性发作,影响精神运动发育,常规抗癫痫药物疗效不好,预后差。Dravet综合征的分子遗传学研究显示,70-80%的患者存在钠通道SCN1A基因突变。目前有DS小鼠模型、诱导性多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSc)模型证实钠通道SCN1A基因突变导致的钠通道功能受损是主要的致痫机制。但仍约有15%的Dravet综合征患者病因未明。研究发现,3’非翻译区(3’untranslated region,3’UTR)在mRNA的翻译、亚细胞定位以及稳定性中起重要作用。通过影响RNA结合蛋白、miRNA、非编码RNA等与mRNA 3’UTR的结合,在转录后水平影响基因的表达。3’UTR的异常调控将导致蛋白表达异常,从而导致疾病发生。本课题组前期对DS患者进行钠通道SCN1A基因3’UTR突变筛查时发现一个新生突变(NM06920c.*20 AG)。本研究拟对钠通道SCN1A基因3’UTR发现的新生突变进行功能分析,探索其在Dravet综合征中的致病机制。方法一、钠通道SCN1A基因3’UTR突变位点的功能分析1、生物信息学分析:对变异位点采用Vector NTI软件对进行保守性分析,利用RNA structure 5.3对SCN1A基因3’UTR突变位点进行RNA二级结构预测。2、构建双荧光素酶报告基因质粒,转染人畸胎瘤细胞(NT2细胞),检测荧光素酶活性。3、RNA电泳迁移阻滞实验(RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay,RNAEMSA)分析突变位点对非翻译区序列与细胞质蛋白结合的影响。4、荧光定量PCR检测突变位点对报告基因mRNA稳定性的影响。5、RNA-Protein Pull-Down及SDS-PAGE电泳分离与RNA探针结合的NT2细胞质蛋白,Nano LC/MS/MS分析鉴定RNA结合蛋白。结合蛋白EMSA实验进一步证实。二、GAPDH慢病毒干扰试验1、构建RNA结合蛋白GAPDH的慢病毒干扰质粒。2、慢病毒转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)并筛选稳定细胞株。3、Western Blot检测SH-SY5Y细胞GAPDH和Nav1.1蛋白表达情况。结果1、突变位点物种间保守性分析结果发现此位点高度保守。RNA二级结构预测发现,该突变位点显著改变RNA二级结构。2、构建双荧光素酶报告基因重组质粒野生型:psiCHECK2-SCN1A 3U(20A)及突变型:psiCHECK2-SCN1A 3U(20G),转染NT2细胞。检测相对荧光素酶活性,与野生型相比,突变型相对荧光素酶活性降低30%(t=8.5,PG)是功能性突变。突变导致RNA结合蛋白GAPDH与3’UTR的结合能力增强,影响报告基因mRNA的稳定性,在转录后水平负性调控钠通道SCN1A基因的表达。2、NM06920c.*20 AG突变的致痫机制,可能是通过增强GAPDH与钠通道SCN1A基因3’UTR的结合能力,降低Nav1.1 mRNA稳定性,从而减少Nav1.1的表达,导致单倍剂量不足现象。