基于FRET技术研究AhR、HIF-1α与ARNT的相互作用

作     者：张梦迪 

作者单位：内蒙古医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：常福厚

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：芳香烃受体 AhR核易位体蛋白 载体构建 A549细胞 荧光共振能量转移 

摘      要：目的:本研究拟探讨在不同浓度的BaP处理下,采用CoCl2作为HIF-1α的激动剂,在A549细胞中基于FRET技术研究AhR、HIF-1α与ARNT的相互作用,以期对这两条重要的信号通路之间关系的研究提供一定的参考,为科学家们寻找阻断AhR和HIF-1信号通路的药物来预防和治疗癌症提供一定的实验依据。方法:(1)利用分子克隆基因重组技术获得目的质粒:从A549细胞中提取总RNA,采用RT-PCR法克隆目的基因AhR、ARNT片段,通过质粒载体的构建将两个目的基因AhR和ARNT分别重组到荧光表达载体质粒pAcGFP1-N1和pDsRed-Monomer-N1上,得到pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT两个重组质粒。(2)利用荧光共振能量转移实验技术研究AhR、HIF-1α与ARNT的相互作用:pAcGFP1-N1-AhR是目的基因Ah R与GFP融合表达,而pDsRed-Monomer-N1-ARNT是ARNT与pDsRed-Monomer-N1融合表达。检测AhR与ARNT是否发生了相互作用,就等同于检测pAcGFP1-N1和pDsRed-Monomer-N1是否发生了FRET。脂质体转染技术介导pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT两个重组质粒在A549细胞中的表达,用不同浓度的BaP(0μM、2μM、4μM、8μM,作用24h)和CoCl2(300μM,作用24h)处理A549细胞,运用高内涵细胞筛选系统的荧光成像模块,研究在A549细胞中用CoCl2激动HIF-1α进入核内时,根据荧光重组质粒的荧光强度的变化情况,判断AhR与HIF-1α是否竞争结合ARNT。结果:(1)成功构建pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT两个重组质粒,经酶切鉴定和DNA序列测定鉴定载体构建成功,转染细胞后pDsRed-Monomer-N1-ARNT和pAcGFP1-N1-AhR两个重组质粒在A549细胞中成功表达,转染率分别为15%和19%。(2)在细胞质中可观察到绿色荧光信号,在细胞核中可观察到红色荧光信号,表明这两种重组质粒在A549细胞中成功表达。此外,我们发现在细胞核中可检测到FRET荧光信号,表明AhR与ARNT在核内发生相互作用。(3)用不同浓度的BaP(0μM、2μM、4μM、8μM,作用24h)处理转染入A549细胞中的pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT两个重组质粒,FRET荧光信号强度与对照组相比明显增强且呈剂量依赖性,当BaP浓度为8μM时,FRET荧光信号强度约为对照组的2.3倍,且差异具有显著性(P0.05)。(4)加入300μM CoCl2和BaP 8μM处理24h后,FRET荧光信号强度与只加BaP 8μM,作用24h相比明显减弱,处理组的荧光信号强度为之前的0.6倍。结论:BaP能上调pAcGFP1-N1-AhR和pDsRed-Monomer-N1-ARNT两个重组质粒的FRET荧光信号并呈剂量依赖性;CoCl2处理后FRET荧光信号强度减弱说明HIF-1α竞争AhR结合ARNT蛋白,进一步说明HIF-1α信号通路的激活抑制AhR信号通路。