人工蛹虫草的液体发酵与血清药物化学的初步研究

作     者：曹灵杰 

作者单位：广东药科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：朱家勇

授予年度：2017年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 0836[工学-生物工程] 082203[工学-发酵工程] 0822[工学-轻工技术与工程] 10[医学] 

主      题：人工蛹虫草 液体发酵 发酵工艺 指纹图谱 血清药物化学 

摘      要：冬虫夏草是我国名贵的传统中药及保健品。蛹虫草别名北冬虫夏草,具有与冬虫夏草相似的活性成分和药理作用,有望成为代替冬虫夏草的新型真菌药源。蛹虫草市场需求巨大,野生资源稀缺,因此其开发研究成为近年来的热点问题。目前研究大多数集中在活性成分的提取与功能研究方面,对于蛹虫草液体发酵过程中活性成分的形成过程研究不多,同时蛹虫草在体内的药效物质基础还不明确。本论文选取蛹虫草菌种,对蛹虫草液体发酵过程中主要活性成分的代谢变化及液体发酵工艺进行研究,并在此基础上,通过对蛹虫草、蛹虫草菌丝体及蛹虫草液体发酵液的指纹图谱及其给药血清图谱进行相关性研究,分析蛹虫草及其液体发酵产物的入血移行成分,初步探讨其可能的药效物质基础。研究目的:1.研究蛹虫草液体发酵过程中主要活性成分的代谢变化,确定各类活性成分的最佳收集时间;2.对蛹虫草液体发酵条件进行优化,确定最佳发酵工艺;3.研究蛹虫草、蛹虫草菌丝体及蛹虫草液体发酵液的指纹图谱及其给药血清图谱的相关性,初步探讨其可能的药效物质基础。研究方法:1.蛹虫草液体发酵过程主要活性成分的代谢变化研究:选取蛹虫草菌种GIM 5.270,以菌丝体产量为指标,对蛹虫草液体发酵的基础培养基进行筛选。在此基础上,延长蛹虫草液体发酵时间,根据发酵体系中不同活性成分,采取相应的分析方法检测不同时间点菌丝体与发酵液中主要活性成分的含量:其中总糖采用苯酚-硫酸法;还原糖采用DNS法;虫草酸采用比色法;虫草素与腺苷采用HPLC。并且根据发酵体系中蛹虫草活性成分的分布情况及代谢变化,确定各类活性成分的最佳收集时间。2.蛹虫草液体发酵过程中的工艺研究:在最佳收集时间的基础上,以菌丝体及胞外粗多糖产量为指标,采用单因素实验分别考察营养因子(包括碳源、碳源用量、氮源、复合氮源比例、氮源用量、无机盐比例、无机盐用量、VB1用量)及培养条件(温度、摇床转速、p H值、装液量)对活性成分产量的影响,并在此基础上,通过营养因子正交实验和培养条件正交实验对液体发酵工艺进行优化,筛选蛹虫草的最佳液体发酵工艺。3.蛹虫草血清药物化学的初步研究:首先通过对洗脱梯度、检测波长、柱温、流动相、洗脱速度、上样体积的筛选,建立蛹虫草药材的HPLC指纹图谱分析方法。随后对10批次蛹虫草提取液进行HPLC指纹图谱相似度评价,建立蛹虫草对照指纹图谱,并进行方法学验证,同时建立人工培养的菌丝体、发酵液相应的对照指纹图谱,对三类产物进行质量比对分析。在此基础上,将蛹虫草三类产物提取液分别进行大鼠灌胃给药,获得给药血清,使用与蛹虫草指纹图谱相同的色谱条件,测定给药血清的HPLC指纹图谱,并与对照指纹图谱进行比对,分析入血移行成分。研究结果:1.蛹虫草液体发酵过程主要活性成分的代谢变化研究:蛹虫草液体发酵基础培养基的筛选结果显示,马铃薯综合PDA培养基的菌丝体产量最高。蛹虫草液体发酵过程中菌丝体与发酵液中的主要活性成分检测结果显示:随着时间的进行,菌丝体越来越多,发酵液越来越澄清;发酵体系中虫草多糖与虫草酸含量均呈先增高后降低的趋势,其最佳收集时间在8 d左右;腺苷含量呈逐渐降低趋势,最佳收集时间在5 d左右;虫草素含量呈逐渐增高趋势,最佳收集时间在15 d左右。2.蛹虫草液体发酵过程中的工艺研究:单因素实验与正交实验结果显示蛹虫草液体发酵培养基的最佳营养因子为:20%马铃薯汁1 L,葡萄糖20 g,蛋白胨16 g,酵母粉5 g,KH2PO4 2.5 g,Mg SO4 2 g,VB1 16 mg;最佳培养条件为:21℃,150 r,p H 6.0(自然),装液量90 m L(300 m L锥形瓶),无光照。在此工艺下,菌丝体与粗多糖的综合产量可达到11.22 g/L。3.蛹虫草血清药物化学的初步研究:HPLC检测确定蛹虫草指纹图谱分析方法为:Age La Venusi L ASB C18(5 um,4.6×150 mm)色谱柱;流动相甲醇-水;检测波长260 nm;流速1.0 ml/min;柱温25℃;进样量10 u L;50 min梯度洗脱。采用相似度评价软件对10批次蛹虫草提取液指纹图谱进行处理,得到蛹虫草对照指纹图谱进行比对相似度均0.9。同时建立了菌丝体与发酵液指纹图谱,三类产物中均可观察到腺苷峰与虫草素峰,菌丝体中腺苷含量更高,发酵液中则虫草素含量更高,菌丝体与蛹虫草之间的共有峰更多。大鼠给药血清HPLC指纹图谱与对照指纹图谱比对分析结果显示,蛹虫草给药血清指纹图谱中标定了7个移行成分在空白血清中未出现,其中5个为原型成分,2个为代谢或应激产物成分;菌丝体给药血清中标定了6个移行成分在空白血清中未出现,都为原型成分;发酵液给药血清中标定了7个移行成分在空白血清中未出现,其中5个为原型成分,2个为代谢或应激产物成分,其中在三类产物提取液中均有2个原型成分分别被指认为腺