siRNA干扰Slug基因表达对IEC-6细胞放射线敏感性影响

作     者：高清华 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张林

授予年度：2017年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 08[工学] 

主      题：Slug基因 RNA干扰 P53正向凋亡上调因子 放射敏感性 

摘      要：目的通过研究siRNA干扰Slug基因表达对体外肠隐窝细胞IEC-6接受X线照射的敏感性影响及机制,探讨Slug基因对肠道干细胞的保护作用,为减轻正常肠道组织的辐射损伤寻求新的策略。方法(1)以体外培养的大鼠小肠隐窝上皮细胞IEC-6为研究对象,针对已知的Slug基因的c DNA序列,设计并合成3条特异性序列(siRNA-Slug-1、siRNASlug-2、siRNA-Slug-3)和1条非特异性序列(siRNA-NC)。(2)利用锐博生物公司提供的转染技术对IEC-6细胞进行瞬时转染。将细胞分为三组,分别为:实验组,阴性对照组和空白对照组。实验组细胞转染siRNA-Slug小干扰RNA,阴性对照组转染siRNA Negative Control(siRNA-NC),空白对照组不转染任何小干扰RNA。(3)在荧光显微镜下观察细胞的转染效率,选择最佳转染浓度和转染时间进行后续实验。(4)采用Western blot法检测各组细胞Slug基因被干扰后在蛋白水平的表达变化,以及Slug基因被沉默的同时PUMA蛋白水平的表达变化。(5)通过CCK8实验检测沉默Slug基因联合放疗对IEC-6细胞增殖情况的影响。(6)流式细胞仪(FCM)检测各组细胞的凋亡率。(7)克隆形成实验观察IEC-6细胞的放射敏感性。(8)采用SPSS21.0和Graph Pad Prism5软件进行统计分析,计量资料结果以?χ±S形式表示,数据间比较采用单因素方差分析,以P0.05表示差异有统计学意义。结果(1)利用锐博生物公司提供的转染技术能够成功将siRNA-Slug瞬时转染入IEC-6细胞。(2)利用Western blot成功筛选出干扰效果最好的siRNA-Slug。同时Western blot结果显示:经X线照射,实验组细胞内的Slug蛋白表达与阴性对照组和空白对照组相比明显降低(P0.01);实验组细胞的PUMA蛋白表达明显高于阴性对照组和空白对照组(P0.01),且随着实验组细胞内的Slug蛋白表达的下调,PUMA的蛋白表达增高。(3)CCK8结果显示在0Gy剂量范围内,随着X线剂量的增加,细胞的增殖活性降低;在6Gy剂量下,实验组与阴性对照组和空白对照组比较,生长抑制率明显增高,差异有统计学意义(P0.01)。(4)流式细胞术显示经X射线照射后,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞的凋亡率增加,差异有统计学意义(P0.01)。(5)细胞克隆形成实验表明,实验组细胞的存活分数明显低于阴性对照组和空白对照组,差异具有统计学意义(P0.01)。结论siRNA干扰Slug基因表达能够增强IEC-6细胞对X射线的敏感性,其机制是通过诱导PUMA表达上调实现的。