黄芪甲苷对肾血管性高血压大鼠主动脉内皮细胞线粒体损伤的保护研究
作者单位：南京医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：朱铁兵
授予年度：2014年
主 题：黄芪甲苷 肾血管性高血压大鼠 主动脉内皮细胞 线粒体 锰超氧化物歧化酶
摘 要：背景 血管壁是由内层内皮细胞、中层平滑肌细胞、外层结缔组织构成的。血管内皮细胞（EC）是位于血液与血管组织之间的一层扁平细胞,作为血液和组织之间的屏障,不仅来维持血管壁的完整,完成血液和组织液的代谢交换,还可合成和分泌多种生物活性物质,以保证血管正常的收缩和舒张功能,起到调节血管张力、调节血流、血压的作用。除此之外,它还具有调节凝血与抗凝平衡、防止血栓形成、抑制血管壁细胞的游走和增殖等多种重要的生理功能。血管内皮细胞衰老、凋亡与再生的平衡对正常血管的功能维持具有极其重要的作用。线粒体作为细胞内的重要细胞器,除了合成ATP为组织细胞提供能量外,还调控制细胞程序性死亡、以及细胞衰老等多种病理生理的代谢过程。线粒体作为细胞供能的主要细胞器很容易受到机体内部和外界各种不良因素的攻击,血管内皮细胞线粒体的功能障碍或损伤,必然会导致血管内皮正常生理功能的维持。因此,保护血管内皮细胞线粒体的损伤在防治心血管疾病中有重要意义。 黄芪甲苷（Astragaloside IV, AS-IV）是从中药黄芪中分离得到的具有多种药理活性的皂苷类化合物,是黄芪主要活性成分之一,具有抗氧化特性,有调节机体免疫力、保护组织器官、降低血糖、抗细胞凋亡和抗炎抗病毒等药理作用。研究表明,AS-IV能够通过提高线粒体膜电位减轻线粒体损伤,保护视网膜神经节细胞,还可通过降低线粒体氧化应激产物来减少心肌细胞的凋亡[1-2]。因此,我们进一步推测AS-IV对主动脉内皮细胞线粒体损伤具有保护功能,但AS-IV对线粒体保护作用的确切机制尚不明确。 目的 本研究旨在证实AS-IV对肾血管性高血压大鼠主动脉内皮细胞线粒体损伤的保护作用并探索其可能机制,将有益于开发AS-IV药物作用靶点。 方法 1、肾血管性高血压大鼠模型的建立及血压监测 清洁级SD大鼠麻醉固定后暴露左侧肾脏,钝性分离左侧肾动脉,于肾动脉中段放置银夹（内径0.2mmm）,缩窄肾动脉。术后分笼,置于室温,苏醒后给予常规饮食。采用大小鼠无创血压仪BP-2000系统,经套尾法分别于术前、术后每周测量各组大鼠血压,每只大鼠血压测量10次,取平均值;术后2周收缩压140mmHg（1mmHg=0.133kPa）作为高血压模型制作成功标准,用于进一步实验。 2、实验分组与治疗 实验分为假手术组（SHAM组）、两肾一夹组（2K1C组）、黄芪甲苷低剂量组（AST-L组,1.0mg/（kg-d））、黄芪甲苷高剂量组（AST-H组,5.0mg/（kg-d））、洛沙坦钾组（LOS组,10mg/（kg-d））、黄芪甲苷高剂量+洛沙坦钾组（AST-H+LOS组,5.0mg/（kg-d）+10mg/（kg-d））。AST-L组、AST-H组、LOS组和AST-H+LOS组于术后2周腹腔注射给药,SHAM组和2K1C组给予等体积生理盐水腹腔注射。 3、通过电子透射显微镜观察大鼠胸主动脉内皮细胞线粒体 通过透射电镜观察大鼠胸主动脉内皮细胞线粒体内外膜的清晰度、线粒体嵴的完整性、线粒体基质电子密度的高低变化及线粒体肿胀情况。 4、应用免疫组化染色法观察大鼠主动脉内皮细胞锰-超氧化物歧化酶（SOD2）的表达 大鼠主动脉内皮细胞SOD2免疫组化检测,采用形态学图像分析系统Image-ProPlusVersion6.0软件进行主动脉内皮细胞阳性染色面积和总光密度值的测量,计算得出平均光密度值（IOD/area）,以平均光密度值代表SOD2的表达水平。 结果 1、鼠尾法测定大鼠血压显示,手术前各组大鼠基础血压差异无统计学意义（P0.05）。术后两周末,2K1C组、AS-IV低剂量组、AS-IV高剂量组、LOS组、AS-IV高剂量+LOS组与SHAM组比较收缩压明显升高,差异有统计学意义（P0.01）。治疗两周后,LOS组、AS-IV高剂量+LOS组与模型组比较收缩压均有明显降低,差异有统计学意义（P0.01）;LOS组、AS-IV高剂量+LOS组与AS-IV低剂量组比较降压效果差异有统计学意义（P0.05）;AS-IV低剂量组与AS-IV高剂量组相比较降压效果差异无统计学意义（P0.05）;LOS组、AS-IV高剂量+LOS组与AS-IV高剂量组相比较降压效果差异无统计学意义（P0.05）。 2、电镜下可见,SHAM组主动脉内皮细胞线粒体双层膜清晰完整,线粒体嵴、嵴间隙清楚,基质电子密度正常。2K1C组主动脉内皮细胞线粒体的嵴断裂缺失,仅留部分残端,可见明显肿胀、空泡化。AS-IV低剂量组线粒体的嵴模糊不清,有轻度空泡化。AS-IV高剂量组线粒体嵴清楚,但有残端,空泡化明显减轻。LOS组、AS-IV高剂量+LOS组与SHAM组相比较主动脉内皮细胞线粒体超微结构无明显差别。 3、免疫组化结果显示：与SHAM组比较,2K1C组大鼠主动脉内皮细胞SOD2蛋白表达水平显著降低（P0.01）;与2K1C组比较,SHAM组、AS-IV高剂量组、LOS组与AS-IV高剂量+LOS组大鼠主动脉内皮细胞SOD2蛋白表达水平显著增加（P0.05）;经低剂量黄芪甲苷（AS-IV低剂量组）治疗后,与2K1C组比较、大鼠主动脉内皮细胞SOD2蛋白表达水平变化不明显（P0.05）;AS-IV高剂量组、LOS组与AS-IV高剂量+LOS组有显著疗效,三组之间大鼠主动脉内皮细胞SOD2蛋白表达水平相比较差异无统计学意义（P0.05）。 结论 AS-IV对肾血管性高血压大鼠主动脉内皮细胞线粒体的损伤有保护作用,上调主动脉内皮细胞SOD2表达可能是其途径之一。
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