小鼠睾丸支持细胞诱导小鼠胚胎干细胞向生殖细胞分化的实验研究

作     者：杨君杰 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘厚奇

授予年度：2006年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100101[医学-人体解剖与组织胚胎学] 10[医学] 

主      题：ES细胞 支持细胞 共培养 分化 生殖细胞 

摘      要：研究背景和目的 胚胎干细胞(ESC)具有全能性,能够分化成一个完整生命个体所需之各式各样的不同的细胞。ES细胞定向诱导分化是目前国际上研究的热点,其中ES细胞向生殖细胞的分化是一个非常新的领域。近年来,在移植研究中用原始生殖细胞(PGC)和生殖干细胞(GSC)来改善生育已经取得了不同程度的成功,这使研究者们把研究深度进一步加深,用ES细胞作为生殖细胞分化的起始点。到目前为止,共有五个实验室分化成功。这五个实验室都是先将胚胎干细胞分化成类胚体(EB),EBs包含早期胚胎典型的组织系统,再加一些诱导剂或条件培养基或者只是让细胞自发分化,一段时间之后可以检测到生殖细胞标志分子的表达。本研究是将小鼠睾丸支持细胞与ES细胞共培养,支持细胞与ES细胞形成细胞间接触,同时支持细胞还可以分泌一些细胞因子如骨形态发生蛋白(BMP—4),在这两种因素的作用下,诱导ES细胞向生殖细胞分化,目的在于用模拟体内的微环境来诱导ES细胞分化成生殖细胞。我们将小鼠睾丸支持细胞与ES细胞共培养,在一定的时间点用RT-PCR,原位杂交,免疫组化和Western-Blotting检测生殖细胞标志分子的表达;其中鼠vasa同源体(Mvh)的表达有力证实了小鼠ES细胞分化成生殖细胞。通过该研究,我们用模拟体内的微环境诱导ES细胞分化成生殖细胞,建立一种相对稳定的体外分化系统,有助于分析生殖细胞分化过程中的基因演变和外遗传的程序重调,有助于核转移技术的发展和不育治疗。 第一部分 小鼠睾丸支持细胞的分离培养与鉴定 方法:取18～20天雄性ICR小鼠的睾丸,酶消化法原代培养。用RT-PCR的方法克隆带有锌指结构域的支持细胞基因(SERZ),与pcDNA3.0连接后构建重组质