抗菌肽17BIPHE2抑制金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌生物被膜作用的研究

作     者：回丽媛 

作者单位：宁夏医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王秀青

授予年度：2017年

学科分类：1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：抗菌肽 17BIPHE2 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 生物被膜 

摘      要：目的研究抗菌肽17BIPHE2单独使用及联合抗生素对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)生物被膜的抑制作用,并初步探讨抗菌肽17BIPHE2作用细菌后对生物被膜相关基因转录水平的影响,为治疗金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌生物被膜相关感染及药物研发提供了一个新思路。方法1.采用刚果红平板测试法(金黄色葡萄球菌)和结晶紫染色法评估受试菌形成生物被膜的能力;2.微量肉汤稀释法和琼脂平板测试法测定金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌最小抑菌浓度(MIC)、最小杀菌浓度(MBC);3.利用生物被膜早期黏附实验观察17BIPHE2单独使用及联合抗生素对生物被膜黏附阶段的影响;4.利用生物被膜形成抑制实验观察17BIPHE2单独使用及联合抗生素对生物被膜形成阶段的影响;5.通过扫描电子显微镜(SEM)观察17BIPHE2单独使用及联合抗生素是否具有清除成熟阶段生物被膜的作用;6.采用激光共聚焦激光扫描显微镜(LSCM)观察17BIPHE2是否具有杀伤成熟铜绿假单胞菌生物被膜内细菌的作用;7.利用Real-Time PCR分析17BIPHE2作用细菌后对生物被膜相关基因转录水平的影响。结果1.经刚果红平板测试法和结晶紫染色法评估临床分离株SA 05具有较强形成生物被膜能力,临床分离株SA 07不具有形成生物被膜的能力;经结晶紫染色法评估临床分离株PA 03具有较强的形成生物被膜能力,临床分离株PA 07不具有形成生物被膜的能力;2.17BIPHE2对金黄色葡萄球菌MIC值为8μmol/L,1/2×MIC就可以有效抑制浮游菌的生长。17BIPHE2对铜绿假单胞菌MIC值为48μmol/L,亚抑菌浓度也可以有效抑制浮游菌的生长。17BIPHE2联合抗生素使用较单一使用MIC值均有所下降;3.单独使用17BIPHE2在金黄色葡萄球菌黏附阶段抑制率为40%,17BIPHE2联合抗生素使用较单独使用抗生素其抑制效果有所提升。单独使用17BIPHE2在铜绿假单胞菌黏附阶段抑制率为60%,17BIPHE2联合抗生素使用与上述结果相似,较单独使用抗生素抑制率有所提高;4.在金黄色葡萄球菌生物被膜形成阶段17BIPHE2单独使用抑制率达到35%,而在铜绿假单胞菌生物被膜形成阶段17BIPHE2单独使用抑制率达到80%。值得注意的是,17BIPHE2在1/4×MIC也可以显著抑制两种细菌产生生物被膜。17BIPHE2联合抗生素结果显示较单独使用抗生素其抑制生物被膜产生能力均有所提高;5.经扫描电子显微镜观察,17BIPHE2在1/4×MIC浓度即可促进金黄色葡萄球菌成熟生物被膜消散,1×MIC生物被膜消散同时细菌黏附量有所下降,联合万古霉素促进生物被膜消散同时细菌胞质大量外泄。17BIPHE2促进铜绿假单胞菌成熟生物被膜消散效果与上述结果相似,亚抑菌浓度即可促进铜绿假单胞菌生物被膜消散;随着药物浓度提高细菌黏附量急剧下降,并且呈现剂量依赖关系。当17BIPHE2浓度达到1×MIC时细菌完整形态几乎消失,生物被膜消散同时细胞质外泄;抗菌肽联合环丙沙星清除生物被膜作用尤为显著;6.采用激光共聚焦扫描显微镜观察单独17BIPHE2处理铜绿假单胞菌生物被膜后发现,随着药物浓度的提高,细菌黏附量逐渐下降,死菌数逐渐增多,并且呈现明显的剂量依赖关系。当抗菌肽浓度提升至1×MIC,活菌数和死菌数均明显下降。17BIPHE2联合抗生素处理组较单独使用抗生素处理组细菌黏附量显著下降,杀菌作用明显提高;***-Time PCR结果表明,随着17BIPHE2浓度提高,金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌生物被膜相关基因在转录水平表达量均出现不同程度的抑制,且高浓度处理组抑制作用更为明显。结论抗菌肽17BIPHE2具有良好的抑制金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌生物被膜黏附、聚集作用,并可促进成熟生物被膜消散。17BIPHE2辅助抗生素抗生物被膜作用进一步提高。17BIPHE2可以有效抑制生物被膜相关基因的转录,这将为治疗由金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌生物被膜引起的相关感染提供了一个新思路。