PCR检测大鼠血液及腹水中细菌DNA对肠道吻合口漏的早期诊断价值

作     者：雷姗姗 

作者单位：中南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李铁钢

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 100215[医学-康复医学与理疗学] 10[医学] 

主      题：吻合口漏 多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) 细菌 lacZ基因 16SrRNA基因 诊断 

摘      要：研究背景吻合口漏是肠道手术术后一组严重的并发症，各家报告其发生率不一，国外报告结直肠瘘为4％—15％。一旦发生，病程变化很快，如不能及时诊治，可出现继发性腹膜炎、败血症、全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能衰竭(MOF)等并发症，危及生命。因此，早期诊断与及时处理吻合口漏是改善预后、降低疾病死亡率的关键。吻合口漏早期发生隐匿，目前仍缺乏有效的早期诊断方法，往往是通过后期典型肠瘘的临床表现才得以确诊。寻找一个既符合临床需要，又简便迅速、准确客观的方法，从而能有效辅助吻合口漏的早期诊断，一直是众多研究者关注的焦点和从事胃肠临床工作者的一种渴求。本实验利用wistar大鼠建立不同肠段的常规肠切除肠吻合及肠漏模型，应用PCR技术动态检测大鼠血液及腹水中细菌DNA(大肠杆菌的lacZ基因和多数细菌共有的16SrRNA基因)，研究不同样本的lacZ基因和16SrRNA基因的PCR检测对空、回、结肠肠吻合口早期诊断的价值。 目的研究与探讨应用PCR检测大鼠血液及腹水中细菌DNA对肠道吻合口漏的早期诊断价值。 方法健康wistar雌性大鼠65只，随机分成：A组(n=5)为假手术组，只翻动肠管，不行特殊处理;B组(n=10)为结肠—结肠吻合组，C组(n=10)为结肠吻合口漏组，两组在距回盲部以下约10cm处用血管钳阻断约3cm长结肠肠管的血流并用0号线结扎血管，斜形切除此段肠管后，B组用0号丝线行端端吻合(单层间断吻合)，C组用0号线行后壁和两侧壁的单层间断吻合，留前壁5mm不吻合;D组(n=10)为空肠—空肠吻合组，E组(n=10)为空肠吻合口漏组，F组(n=10)为回肠—回肠吻合组，G组(n=10)为回肠吻合口漏组，D、E两组于Treitz韧带以下15cm处用血管钳阻断约3cm长肠管的血流，0号线结扎血管，斜形切除此段肠管，D组用0号丝线行端端吻合(单层间断吻合)，E组用0号线行后壁和两侧壁的单层间断吻合，留前壁5mm不吻合。F、G组于回盲部以上约15cm处用血管钳阻断约3cm长肠管的血流并用0号线结扎血管，斜形切除此段肠管后，F组用0号丝线行端端吻合(单层间断吻合)，G组均用0号线行后壁和两侧壁的单层间断吻合，留前壁5mm不吻合。其中B、C两组构成Ⅰ大组，为结肠吻合口实验组，D、E、F、G构成Ⅱ大组，为空、回肠吻合口实验组。A组和第Ⅰ组于术后第3天及术后第6天取静脉血1mL和3mL。第Ⅱ组于术后36小时取静脉血1mL，术后72小时取血3mL及腹水1—2mL。以酚抽提法提取血液及腹水中DNA，PCR扩增大肠杆菌的lacZ基因和细菌共有的16SrRNA基因，所得数据行卡方检验处理，取肠管标本HE染色做病理学检查，观察其在不同吻合情况下的损伤程度。 结果1、结肠吻合口漏外周血lacZ基因的PCR阳性率显著高于结肠—结肠吻合组的阳性率(P0.05);结肠吻合口漏组外周血16SrRNA基因的阳性率与结肠—结肠吻合组的阳性率无显著差异性(P0.05)。2、空、回肠吻合口漏组的术后外周血lacZ基因的PCR阳性率与空肠—空肠、回肠—回肠吻合组相比无统计学差异(P0.05);空、回肠吻合口漏组的术后腹水PCR阳性率高于空肠—空肠、回肠—回肠吻合组(P0.05);通过腹水标本检测空、回肠吻合口漏组lacZ基因的阳性率显著高于相应外周血标本(P0.05)。3、空、回肠吻合口漏组的术后外周血16SrRNA基因PCR阳性率高于空肠—空肠、回肠—回肠吻合组(P0.05);空、回肠吻合口漏组术后腹水PCR的阳性率高于空肠—空肠、回肠—回肠吻合组腹水16SrRNA靶基因的阳性率(P0.05);通过腹水标本检测空、回肠吻合口漏组16SrRNA的阳性率与外周血标本相比无明显差异(P0.05)。4、空、回肠吻合口漏组术后外周血lacZ基因总阳性率显著低于术后外周血16SrRNA基因的总阳性率(P0.05);术后腹水lacZ基因和16SrRNA基因总阳性率之间无显著性差异(P0.05)。5、病理检查显示：A组显示空肠、回肠及结肠各肠段的正常结构，粘膜上皮排列整齐，腺体正常;D、F两组术后72h粘膜病变轻，小肠绒毛排列尚整齐，纹状缘欠清晰，柱状上皮细胞水肿;E、G组，光镜下见大量绒毛上皮细胞坏死脱落，并且有向绒毛基底部扩展趋势，粘膜固有层出血，隐窝细胞肿胀，粘膜下层及肌层水肿、由较多含颗粒的炎症细胞浸润;结肠实验组中，B组粘膜轻度水肿，纹状缘较清晰，柱状上皮细胞稍水肿;C组粘膜水肿明显，上皮细胞脱落明显增加，粘膜下水肿、充血，隐窝及肌层明显水肿，见大量炎症细胞浸润。 结论1、以PCR方法检测术后外周血中大肠杆菌lacZ基因对结肠吻合口漏的诊断有一定的意义，而以PCR血中细菌16SrRNA基