人DR5胞外段基因的克隆、表达及其单克隆抗体的制备

作     者：陈居杲 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马远方;沈倍奋

授予年度：2007年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：DR5 凋亡 单克隆抗体 

摘      要：背景 死亡受体5(death receptor , DR5)是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand, TRAIL)的主要受体之一,DR5与TRAIL结合后可以通过其胞内的死亡结构域传递凋亡信号,从而引起细胞凋亡的发生,是激活凋亡途径的很好的靶标。TRAIL可引起许多肿瘤细胞系的凋亡,对绝大多数正常细胞不具有凋亡效应,被认为是癌症治疗的潜在的生物制剂。随着研究的深入,出现了关于TRAIL可以引起正常肝脏细胞的凋亡的报道。于是人们转入了对抗DR5单克隆抗体的研究上来。由于TRAIL的功能发挥主要靠DR5介导凋亡信号,如能得到没有肝脏细胞毒性又能活化DR5的单克隆抗体,将可以做为TRAIL的替代物进行药物研制。 目的 获得具有生物活性的人DR5胞外段蛋白,制备具有活性的抗DR5单克隆抗体。 方法 通过RT-PCR从Jurkat细胞中钓取DR5的胞外段基因(55-183位氨基酸),克隆到pGEM?-T Easy载体中,经核酸序列测定正确后,将其再次克隆入原核表达载体pET-30a中,在*** BL21 (DE3)实现蛋白表达。通过SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物。ELISA法分析其与抗DR5单克隆抗体(mAb)结合能力,用DR5胞外段竞争阻断TRAIL对Jurkat细胞生长的抑制。通过杂交瘤技术筛选抗DR5单克隆抗体(A6)。MTT法检测了A6对Jurkat细胞的生长抑制作用。吉姆萨染色、PI/Annexinv双染检测了A6对Jurkat的凋亡作用。通过竞争ELISA方法分析了A6和TRAIL的作用位点的异同。 结果 克隆到人DR5基因的胞外段基因,测序结果和报道的一致;构建了人DR5胞外段基因的原核表达载体并实现在*** BL21 (DE3)中大量表达;SDS-PAGE表明所表达蛋白与预期蛋白分子量一致;Western blot及ELISA的结果表明该蛋白能与抗DR5抗体反应,竞争阻断试验表明DR5胞外段可阻断TRAIL对Jurkat细胞生长的抑制。 成功制备了一株活性较好的抗DR5单克隆抗体-A6。MTT法显示了A6对Jurkat细胞的生长抑制作用,在25μg/mL的浓度下,作用16小时,可以达到对Jurkat细胞90﹪的生长抑制率。吉姆萨染色从形态上显示了Jurkat细胞的凋亡。PI/AnnexinⅤ双染分析显示:Jurkat细胞经过250 ng/mL浓度的A6作用12小时后,Jurkat细胞的凋亡率可以达到52.46﹪。用40倍浓度的TRAIL和A6做竞争ELISA,结果显示了TRAIL和A6的作用位点是不同的。 结论 (1)成功地制备了具有生物活性的DR5胞外区。 (2)制备了一株抗DR5单克隆抗体A6。