肿瘤特异性MAGE-A3基因重组质粒的构建

作     者：徐磊 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘建华;汪国华

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肿瘤特异性 MAGE-A3 pET-32a 重组质粒 

摘      要：背景与目的 肿瘤严重危害现代人类的健康及生命，特别是恶性肿瘤，具有很高的致死率。目前人们对肿瘤的治疗主要依靠外科手术以及放疗、化疗等，近年来以肿瘤生物学特性为出发点研究新的肿瘤治疗方法成为了一个重要的研究方向，基因免疫治疗就是其中的热点之一。 肿瘤基因免疫治疗具有肿瘤高度特异性的特点，对正常细胞及组织几乎不产生损伤。它依赖于细胞免疫和体液免疫两大免疫系统的活化，而保证免疫治疗成功的关键是发现并鉴定肿瘤特异性抗原。 黑色素瘤相关抗原3(Melanoma-asSOCiated antigens 3，MAGE-3、MAGE-A3)作为人类已经发现并鉴定的肿瘤特异性抗原，广泛表达于人体的多种肿瘤组织及细胞，如黑色素瘤、头颈部鳞癌、肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等等。MAGE-A3基因在其他正常的组织中均不表达，除了睾丸生殖细胞。但是睾丸生殖细胞因为不表达MHC-Ⅰ／Ⅱ类分子因而不能递呈MAGE抗原蛋白，所以MAGE-A3基因编码抗原蛋白的表达不会引起免疫系统对睾丸组织的损害。基于这些发现，人们对将MAGE-A3用于特异性的抗肿瘤免疫治疗产生了浓厚的兴趣。 经过多年的努力，人们发明的以MAGE基因为基础的疫苗类型主要有：MAGE抗原肽／蛋白、表达MAGE蛋白的黑色素瘤细胞、附加了MAGE抗原肽或者基因的树突状细胞(Dendritic Cells，DCs)等等。蛋白疫苗的特点是含有己知和未知的CD8T细胞表位和CD4T细胞表位，不被特定的HLA表型所限制，既可通过MHC-Ⅰ类分子途径，又可通过MHC-Ⅱ类分子途径激活抗肿瘤免疫应答，因此采用蛋白疫苗可能具有更大的临床应用意义。 本实验通过RT-PCR方法从舌鳞癌细胞株Tca8113中扩增出MAGE-A3全长蛋白编码序列，并将其克隆到原核表达载体pET-32a中构建出pET-32a／MAGE-A3重组载体，为进一步对重组载体的抗原蛋白的诱导表达及其表达产物在体内外特异性诱导细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)杀伤活性的研究提供实验依据。 方法 1、网上查询获得MAGE-A3基因序列，确定其编码蛋白质的序列全长。 2、设计引物扩增编码蛋白质的目的片段，同时参照质粒载体pET-32a的图谱在引物两端分别增加酶切位点SacⅠ和XhoⅠ。 3、复苏、培养舌鳞癌细胞株Tca8113，收集细胞，通过RT-PCR扩增出目的片段，目的片段切胶回收。 4、回收目的片段通过TA克隆进行转化、扩增，酶切鉴定，重组载体测序，并与网上序列比对同源性。 5、用SacⅠ和XhoⅠ核酸内切酶双酶切重组T载体和pET-32a质粒载体，进行连接，从而构建pET-32a／MAGE-A3原核表达重组质粒。 结果 1、通过RT-PCR可以从舌鳞癌细胞株Tca8113中扩增出目的片段。 2、通过TA克隆可以获得成功转化的重组T载体，测序结果与网上序列有很高的同源性，并且未出现提前终止密码子。 3、通过双酶切重组T载体和pET-32a质粒载体可以将目的片段与pET-32a质粒载体重组，构建出重组原核表达质粒pET-32a／MAGE-A3。 结论 本实验成功从舌鳞癌细胞株Tca8113中扩增出MAGE-A3编码蛋白质的全长序列，并且将其克隆到质粒pET-32a中形成原核表达的重组载体，为下一步对重组载体的抗原蛋白的诱导表达及其表达产物在体内外特异性诱导CTLs杀伤活性的研究提供实验依据。