雄激素通过激活Egr1通路调控内皮祖细胞生物功能的研究

作     者：李曦哲 

作者单位：上海交通大学 

学位级别：硕士

导师姓名：叶一舟

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：雄激素 双氢睾酮 内皮祖细胞 早期生长反应因子 

摘      要：目的:探究雄激素对内皮祖细胞(EPC)的体外血管形成能力、迁移能力的影响,及对体内EPC血管新生功能影响。并初步探讨了参与这一过程的相关机制。方法:密度梯度离心法提取小鼠骨髓单个核细胞,EBM-2培养基诱导分化为EPC。DiI染色及流式细胞术鉴定分化后EPC。培养第2天,以含不同浓度双氢睾酮(DHT)的条件培养基干预EPC。于第4、5、7、9、11天分别抽取EPC全RNA行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达量。培养第7天,行体外管样结构结合实验及Transwell小室迁移实验。制作小鼠下肢缺血模型,以DHT或未处理的EPC局部肌肉注射治疗小鼠下肢缺血,激光多普勒检查评价小鼠缺血后肢血流灌注恢复情况,免疫荧光观察缺血部位毛细血管新生密度及GFP标记EPC存活量。设计早期生长反应因子1(Egr1)siRNA干扰片段。进行体外管样结构结合实验及Transwell小室迁移实验,比较DHT处理组及DHT+Egr1 siRNA转染组EPC的血管形成及迁移能力,评估Egr1是否参与DHT对EPC血管生成能力及迁移能力的调控。结果:DiI染色及流式细胞术鉴定结果显示诱导分化的细胞特征符合EPC特点。RT-PCR结果显示DHT以剂量依赖性及时间依赖性的方式显著增强EPC中VEGF表达量,这一增强作用于培养第7天、10nmol/L浓度达到高峰(P0.05)。体外管样结构结合实验及Transwell小室迁移实验结果显示DHT以剂量依赖性的方式显著增强EPC的血管形成能力及迁移能力(P0.05),且这一增强作用于10nmol/L浓度达到最强。小鼠下肢缺血模型制作成功,激光多普勒检测显示DHT处理的EPC治疗的小鼠下肢血流灌注恢复明显较未处理EPC组及对照组为高(P0.05),免疫荧光结果显示注射DHT处理的EPC组缺血部位毛细血管新生密度显著高于未处理EPC组及对照组,EPC存活率高于未处理EPC组(P0.05)。Egr1 siRNA设计成功,EPC转染Egr1 siRNA效率高于90%,转染后Egr1基因表达抑制率达60%(P0.05)。体外管样结构结合实验及transwell小室迁移实验显示,10nmol/L DHT+Egr1-siRNA转染组EPC的血管形成能力及迁移能力较单纯10nmol/L DHT处理组均明显下降(P0.05)。结论:体外实验显示DHT以剂量依赖性的方式显著增强EPC的血管形成能力及迁移能力,这一增强作用于10nmol/L浓度达到最强。体内实验显示DHT增强EPC在小鼠下肢缺血模型中的移植治疗效果。Egr1是介导DHT调控EPC功能的重要分子。