白及地上部分抗肿瘤作用实验研究

作     者：曹俊敏 

作者单位：浙江中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨汝春

授予年度：2016年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：白及地上部分 化学成分 抗肿瘤 细胞凋亡 

摘      要：目的 提取分离白及地上部分,对醇提取物进行化学成分分析,并对该有效部分进行抗肿瘤活性研究,探讨其体内外抗肿瘤相关作用机制,为白及的综合利用开发提供理论基础。方法 (1)分别采用乙醇回流提取和水提醇沉得到白及地上茎和叶提取物,并对提取物采用HPLC进行化学成分分析。(2)采用MTS法检测白及地上部分醇提物对肺腺癌细胞A549细胞抑制作用。(3)通过Hoechst-PI染色法分析白及地上部分醇提物对A549细胞凋亡的影响。(4)通过二维水平细胞迁移实验研究白及地上部分醇提物对A549细胞的抑制作用。(5)采用RT-PCR技术检测Bcl-2、 Bax及ICAM-1的表达情况。(6)通过建立H22荷瘤小鼠模型,研究白及地上部分醇提物体内抗肝癌的作用,并观察小鼠的生长状况以及机体的免疫功能;采用免疫组化技术分析肿瘤组织中Bax和Survivin蛋白的表达,并检测Bcl-2和Bax基因mRNA的表达。结果 (1)白及地上部分与白及块茎相比较,小分子含量比多糖的含量高,白及醇提物(小分子)中主要化学成分有菲类、二氢菲类等化合物。(2)白及地上部分提取物的抗肿瘤有效部分为醇提物(白及茎和叶醇提物混合作为醇提物有效部位)。(3)不同浓度的白及地上部分醇提物对肺腺癌细胞A549分别处理24h、48h和72h,发现白及地上部分醇提物能够明显降低A549的存活率,且存在剂量依赖关系。(4)Hoechst-PI染色法发现,40μg/ml白及地上部分醇提物作用A549时,Hoechst染色后观察到细胞大量凋亡,细胞的形态也发生改变,细胞核区域变小;50μg/ml时,细胞开始大量死亡,PI染色后可见强红色的荧光。(5)细胞划痕实验检测出白及地上部分醇提物可以抑制肺腺癌细胞在平面的转移。(6)白及地上部分醇提物促进肺腺癌细胞的凋亡主要是通过抑制抗凋亡基因Bcl-2,促进促凋亡基因Bax的表达来实现,它还能抑制ICAM-1基因来减少肺腺癌细胞的转移。(7)白及地上部分醇提物能显著抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长;并且能够调节小鼠机体生理状况,改善生存质量,提高对机体的免疫功能,而且对肝脏和肾脏的毒性作用小。(8)白及地上部分醇提物能使H22荷瘤小鼠肿瘤组织中Bax蛋白表达增加,Survivin蛋白表达下降,且中剂量作用显著;并且也能够通过抑制抗凋亡基因Bcl-2,促进促凋亡基因Bax的表达来诱导肿瘤细胞凋亡从而实现抗肿瘤。结论 白及地上部分醇提物主要含有菲类、二氢菲类等化合物,对肺腺癌细胞A549有显著的抑制作用,且存在剂量依赖关系;并且主要是通过抑制抗凋亡基因Bcl-2,促进促凋亡基因Bax的表达实现的,它还能抑制ICAM-1基因来减少肺腺癌细胞的迁移。白及地上部分醇提物具有抗肿瘤作用,能够调节荷瘤小鼠机体生理状况,改善生存质量,提高对机体的免疫功能,升高肿瘤组织中Bax和降低Survivin的表达。白及地上部分具有潜在的开发利用价值。