塞来昔布增强口腔癌KB/VCR细胞对长春新碱敏感性的初步研究

作     者：闫怡轩 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李伟忠

授予年度：2012年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：环氧化酶-2 塞来昔布 多药耐药 P-糖蛋白 口腔癌 

摘      要：口腔癌是常见的头颈部恶性肿瘤之一,近年来口腔癌的发病率呈现明显增高趋势、且发病低龄化,已成为威胁人类健康的重要疾病之一。口腔癌的首选治疗方法是外科手术治疗,而化学治疗是口腔癌重要的辅助治疗方法之一。目前化疗所面临的主要问题是肿瘤细胞对化疗药物敏感性的下降,导致多药耐药(Multidrug resistant, MDR)的产生,使肿瘤细胞产生具有同时抵抗具有不同结构和功能作用的广谱化疗药物的能力。目前认为,肿瘤细胞这种多药耐药的形成,与包括P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)在内的膜泵出蛋白的过度表达密切相关。 P-gp是源于ATP-结合盒家族(ATP-binding Cassette superfamily,ABC)的种跨膜磷酸糖蛋白,由MDR-1基因编码。P-gp是一种具有ATP酶活性的跨膜泵,其作用底物可以是内源性的物质(如细胞因子、类固醇激素等),也可以是外源性的物质(如化疗药物等)。P-gp具有将大量化合物,尤其是水合阳离子的化合物从细胞内泵至细胞外间隙的功能,从而导致细胞内P-gp作用底物浓度的降低。当抗肿瘤药物作用于肿瘤细胞时,脂溶性药物通过浓度梯度而进入细胞内,药物在细胞内与P-gp结合后,P-gp通过水解ATP获得能量将细胞内药物泵出细胞外,从而导致细胞内药物的浓度不断下降,使药物对细胞的损害减弱并直至消失,最终产生耐药性。不同组织细胞中P-gp的作用不同,如在肠道主要影响药物的吸收,在肝脏和肾脏则主要影响药物的代谢与排除,在中枢神经系统和循环系统则主要影响药物的分布,其可降低细胞内的药物浓度从而使机体免受药物的损害。在人恶性肿瘤的研究发现,P-gp的表达水平与肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性及肿瘤患者的生存率呈负相关。有研究认为,不同的个体MDR-1基因是有差异的,但在治疗前MDR-1基因多态性表现并未影响细胞内药物的转运和患者病情的发展。当肿瘤细胞与抗肿瘤药物长期接触后,诱导MDR-1基因扩增并且大量表达P-gp。 环氧化酶(Cycloxygenase, COX)是花生四烯酸转化为前列腺素(Prosta-glandin, PG)过程中的限速酶,直接影响PG的合成并参与机体的许多生理和病理过程。目前已发现COX有2个亚型,即COX-1和COX-2。COX-1是一种在许多组织细胞内持续表达的“结构酶,具有促进生理性前列腺素的合成,调节和维持组织细胞正常生理活动的作用。在保持自身稳定方面,具有重要的生理功能,如调节肾血流量、保护胃黏膜及血小板功能等。COX-2主要存在于中枢神经系统、精囊和肾脏等组织中,而在其他正常组织中检测不到,但当机体有不同的炎症反应和受到促有丝分裂刺激后,则会产生COX-2,催化合成PG而参与炎症反应。各种生长因子、致炎细胞因子、胆汁酸、致癌剂和紫外线光谱照射均可促进COX-2的表达。目前认为,包括口腔癌在内的多种恶性肿瘤的发生、发展与COX-2的过表达有关,其可导致上皮细胞癌变的发生,其影响的方面包括肿瘤发生、细胞外基质的黏附性增强、抗细胞凋亡作用、降低E-cadherin和TGF-p2受体的表达以及增强Bcl-2蛋白的表达等。 近年来研究发现,选择性COX-2抑制剂除可抑制许多类型癌细胞的生长及诱导细胞凋亡外,还能增强抗肿瘤药物对癌细胞的毒性作用。COX-2抑制剂的抗肿瘤活性的作用机制包括抑制细胞分裂周期、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤新生血管生成等,此外研究认为COX-2抑制剂可以通过调节ABC-转运家族中的膜转运蛋白活性而增强肿瘤对化疗药物的敏感性。 在本研究中,我们通过体外实验研究选择性COX-2抑制剂塞来昔布增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR的生长抑制作用及对P-gp表达和功能调节的影响,初步探讨选择性COX-2抑制剂增强KB/VCR细胞对长春新碱敏感性的作用机制。 第一章塞来昔布增强长春新碱对KB/VCR细胞的生长抑制作用 目的：研究COX-2抑制剂塞来昔布与长春新碱联合应用后能否增强长春新碱对人口腔癌耐长春新碱细胞株KB/VCR的生长抑制作用。方法：收集对数生长期KB和KB/VCR细胞,以2×103个/孔浓度分别接种于96孔板,常规培养24h,细胞贴壁后将含长春新碱的培养基,浓度分别为0.375、0.75、1.5和3μmol/L,及不含长春新碱的培养基(对照组),分别加入接种于96孔板的KB和KB/VCR细胞中,培养24、48和72h后,进行MTT实验计算细胞生长抑制率,比较长春新碱对KB及KB/VCR细胞生长抑制率的差异。MTT法检测不同浓度塞来昔布(10、20、40和80μmol/L)对KB及KB/VCR细胞的生长抑制率。本研究采用塞来昔布(10μmol/L)、长春新碱(1.5μmol/L)、塞来昔布+长春新碱(10μmol/L+1.5μmol/L