釉基质蛋白衍生物诱导人牙周膜细胞群向类成牙骨质细胞分化的机制初探

作     者：钟永荣 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：章锦才

授予年度：2010年

学科分类：1003[医学-口腔医学] 100301[医学-口腔基础医学] 10[医学] 

主      题：人牙周膜细胞群 釉基质蛋白衍生物 类成牙骨质细胞 分化 

摘      要：近年来,研究者发现人牙周膜细胞群(human periodontal ligament cell population, HPDLP)是一组具有多向分化潜能的异质性细胞群,含有成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞及未分化的前体干细胞等多种细胞成分,具有合成新生牙骨质、牙周纤维、牙槽骨等的牙周组织功能。这些细胞亚型可处于不同的分化阶段或具有不定向的分化趋势,牙周组织再生修复与牙周膜细胞的异质性有密切关系。牙根发育早期,牙囊细胞、上皮根鞘和牙乳头细胞相互作用,形成了牙根牙周组织。经典理论认为,牙周前体细胞—牙囊细胞穿透断裂的上皮根鞘与牙根接触并相互作用,分化成为成牙骨质细胞并形成牙骨质。在临床实际操作中,牙周炎患牙的牙周洁治与根面平整,以及局部的抗炎处理是促进牙周再生的前提。通过物理或化学的方法进行牙根表面处理,其目的是为了去除牙根表层的玷污层,改善根面周围的局部微环境,暴露新鲜的牙骨质或牙本质,增加局部的趋化刺激因子,以此来诱导牙周细胞的牙根表面贴附性,促进牙周再生。 研究证明釉基质蛋白衍生物(Enamel Matrix Derivatives, EMD,商品名为Emdogain)在体外可以促进牙周韧带细胞(Periodontal ligament cells, PDLC)的黏附、伸展,并且促进其分泌生长因子和细胞因子,其生物学行为类似一种多功能的生长因子。EMD还能诱导多能干细胞系细胞向成骨细胞转化,并能促进成骨细胞系的增殖和分化。将EMD与牙周组织再生(Guided tissue regeneration,GTR)技术结合应用,发现在牙周缺损部位的牙根表面有新的无细胞牙骨质生成,并有成束的胶原纤维埋入其中,恢复了原有牙周膜的解剖结构,提示EMD可促进牙周的完全再生。由于牙周再生的关键环节是牙骨质的再生,而牙骨质形成细胞的存在和功能性活动则是牙周修复再生的细胞学基础。牙齿发育期的Hertwig s上皮根鞘的内层细胞分泌的釉基质蛋白,具有促进牙周膜再生和参与无细胞牙骨质形成的过程。基于这种理论,EMD很可能是一种在牙周再生过程中,通过刺激PDLC增生、并可能诱导PDLC向成牙骨质细胞或成骨细胞分化的基质蛋白。因此认为EMD对人牙周膜细胞群向成牙骨质细胞方向分化有重要作用。 在牙周组织再生中最困难的是牙骨质的再生,目前也是对其了解最少的牙周组织。虽然众多的体内外研究表明,通过物理、化学因素的处理,可以促进牙周组织的再生,包括牙骨质的再生。但对于形成牙骨质的前体细胞即成牙骨质细胞如何从HPDLP分化而来及其机制是什么?仍然还不清楚。因此,本实验拟探讨HPDLP经EMD诱导后能否向成牙骨质细胞方向分化及其可能的诱导机制,为进一步了解HPDLP的定向分化潜能及牙周组织再生奠定基础。 第一章HPDLP的分离培养和鉴定 目的：体外分离培养HPDLP,并进行鉴定。 方法： 1.分离培养HPDLP收集临床因正畸需要拔除的牙周健康、无龋的新鲜前磨牙,刮下根中1／3牙周膜组织,采用组织块法培养。 2.HPDLP的初步鉴定通过免疫细胞化学方法检测培养细胞的波形丝蛋白和角蛋白的表达,对细胞来源进行初步鉴定。 结果： 1.形态学特征：3—6天见多个组织块边缘有细胞开始游出,细胞形态无明显差别,大多数为长梭形。少数为多角形、纺锤状或椭圆形,体积较小,胞体丰满,生长较快,约7—14天开始汇合,以组织块为中心成放射状、漩涡状生长。 2.免疫组织化学特征：免疫组化显示波形丝蛋白染色细胞胞浆可见黄色颗粒,角蛋白染色细胞胞浆未见黄色颗粒。表明细胞较为单一,属于中胚层来源细胞,且无上皮细胞的污染,证实所分离培养的是HPDLP,可用于进一步的研究。 第二章EMD诱导后HPDLP形态观察及在牙骨质片上的贴附、增殖情况 目的：观察HPDLP在EMD诱导下向成牙骨质细胞分化的潜能,为HPDLP在牙周组织再生中的作用提供实验基础。 方法： 1.将HPDLP体外EMD诱导7天,制成细胞爬片,HE染色观察细胞形态.以未加EMD为对照组。 2.制备牙骨质片,分为实验组和对照组,实验组牙骨质片经EMD包被24小时,接种经EMD诱导的细胞,对照组与实验组平行处理,只是细胞及牙骨质片不经EMD处理。诱导7天后,常规生物样本制备,扫描电镜观察牙骨质片上的细胞数量及形态。 3.用MTT法分别检查HPDLP在牙骨质片上的附着(16小时)和增殖(72小时)情况,分为实验组和对照组。 结果 1.HPDLP经EMD体外诱导后,细胞形态发生了明显改变,由梭形的成纤维样细胞变为多角形的类成牙骨质样细胞。 2.扫描电镜观察细胞在牙骨质片上的形态：对照组细胞细长、纺锤形或梭形外形,呈典型的成纤维细胞形状,细胞表面有许多微绒毛。实验组细胞呈多角形或立方形的类成牙骨质样细胞,表面微绒毛明显减少,并可见细胞突起与邻近细胞相连,细胞表面可见大量的细胞外分泌基质。诱导组贴附细胞数比非诱导组明显增多。 3.MTT法检测显示：HPDLP经EMD作用后细胞在牙骨质片上的附着、增殖能力明显增强,与对照组相比,具有显著性差异(贴附：t=-3.318,p=0.008;增值：t=-6.499,p=0.000)。 第三章EMD诱导后HPDLP内成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达 目的： 旨在了解体外培养环境中HPDLP在EMD诱导下,成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达,探索人牙周膜细胞群向成牙骨质细胞分化诱导的机制。 方法： EMD作用HPDLP,分为对照组和实验组。采用免疫细胞化学染色在蛋白水平进行半定量检测成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达,包括碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(typeⅠcollagen,COLⅠ)表达;通过实时定量PCR(RT-PCR)在转录水平检测两组HPDLP中成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达。 结果： 1.免疫细胞化学染色显示：EMD诱导7天：ALP、BSP、COLⅠ、OCN实验组、对照组均有表达;光密度值测量显示：EMD诱导7天ALP、BSP、COLⅠ实验组与对照组之间具有显著性差异(ALP:t=12.731,p=0.000;BSP:t=5.123,p=0.000;COLⅠ:t=-2.859,p=0.010), OCN实验组与对照组之间无显著性差异(t=0.757,p=0.459)。 2.实时定量PCR (RT-PCR)检测结果：EMD诱导7天,实验组ALP、COLⅠ的表达量较对照组明显升高,分别是6.01倍、4.35倍;而OCN表达量无明显升高,实验组是对照组的1.25倍。 全文结论： 1.HPDLP经EMD诱导后在牙骨质片上的贴附、增殖能力增强并向类成牙骨质样细胞方向分化。 2.EMD诱导后HPDLP细胞内的成牙骨质细胞矿化相关蛋白的表达增强,可能是HPDLP向成牙骨质细胞分化诱导的机制之一。 3.HPDLP在EMD诱导下向成牙骨质细胞分化的潜能明显增强。