抑瘤基因NGX6启动子的克隆及初步功能研究
作者单位：中南大学
学位级别：硕士
导师姓名：沈守荣
授予年度：2008年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：研究背景 NGX6基因是中南大学肿瘤研究所分子遗传室采用定位侯选克隆策略克隆的一个侯选抑瘤基因(基因登陆号:AF188239),定位于染色体9p13.3区域。开放阅读框编码的338个氨基酸,分子量为37kDa,具有两个跨膜结构域。胞外区含有一个EGF-like domain,3个N-糖基化位点。胞内区较短,含有一个酪氨酸激酶磷酸化位点。研究表明,NGX6基因在鼻咽癌和结直肠癌中表达明显下降。 前期研究发现NGX6基因能够延缓细胞周期的进程;抑制肿瘤增殖和种植瘤的生长;并能抑制肿瘤血管的生成;降低肿瘤细胞体外侵袭能力,同时恢复肿瘤细胞间隙通讯;并通过抑制核内β-catenin的表达负调控Wnt/β-catenin通路;负调控SPAK/JNK通路并抑制P-JNK核移位;下调EGFR-PKC-IKK-NF-κB通路的关键分子和转录因子;下调Ezrin下游与侵袭相关的通路中信号分子的表达。研究证实,NGX6蛋白的EGF样结构域和胞内区是其调控细胞黏附的重要功能域,胞内区是其调节运动迁移的关键结构域。这些功能研究结果高度提示NGX6在可能肿瘤的发生、发展中发挥一定作用,且与肿瘤的侵袭转移相关。 本课题在前期工作的基础上,研究了NGX6基因的上游分子事件即转录调控研究,希望从调控该基因表达的上游基因的角度,明确该基因具体的表达调控机制,以进一步揭示NGX6基因在肿瘤的增殖、侵袭、转移中的分子机制,深入阐明NGX6基因的生物学功能。 生物信息学分析NGX6基因转录调控区域 首先应用生物信息学方法对NGX6基因5′侧翼区序列进行分析。在线软件PromoterInspector的预测结果显示NGX6基因的调控区-157/+91的区间为其候选启动子区,而在线程序FirstEF分析结果表明-257/+407的区间为NGX6的候选启动子区。运用软件CpGplot和CpGFinder在线扫描NGX6基因的5′侧翼区序列,分别发现其5′上游-107/+299或-21/+310的区间存在一个CpG岛。这两个软件的预测结果大部分重叠,且与NGX6基因候选启动子区域重叠。而TSSW和TRED预测NGX6基因的可能存在多个转录起始位点,这种情况在GC富集启动子区中是常见的,位于-50/+50区间。在线软件MatInspector和TFSEARCH的分析结果显示:NGX6基因启动子区为一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区。它含有多种转录因子结合位点,其中较重要的结合位点有:Sp1、Egr-1、RREB、P53、MYC-MAX和AP2等。 NGX6基因启动子的克隆及鉴定 以正常人外周血细胞基因组DNA为模板,利用PCR技术,获得了NGX6基因调控区长片段-357/+769,并通过荧光素酶活性检测系统证实该区域具有与病毒SV40启动子同等强度的启动活性。接着以该长片段为模板,依据转录因子结合位点预测结果,构建了一系列的缺失突变体报告质粒,定位了NGX6基因的近距离启动子为-159/+276区域。而同时采用绿色荧光蛋白活体检测法进一步验证了-159/+276区域的启动子活性。 转录因子Sp1对NGX6基因表达的影响 真核基因表达调控体系中最关键的是转录起始水平的调控,其基本机制主要包括顺式作用元件、反式作用因子和RNA聚合酶三者之间的相互协同作用,其实质是蛋白质与DNA、蛋白质与蛋白质之间的相互作用。在线软件MatInspector和TFSEARCH分析NGX6基因的近距离启动子区,发现该区域中以转录因子Sp1的结合位点最多,且Threshold值较高。转录因子Sp1结合位点的特异性竞争剂光辉酶素A(Mithramycin A)可大幅度地抑制NGX6启动子活性,并明显下调NGX6基因内源性mRNA表达水平。 总之,我们成功获得了NGX6的启动子区域,并确定了其近距离启动子区域。NGX6基因启动子区域是一个不含TATA盒,而含有CAAT盒的GC富集区,且该调控区内存在一个CpG岛。初步发现转录因子Sp1的抑制剂mithramycin A能够明显地抑制NGX6启动子地活性和NGX6基因的表达。对NGX6基因调控区的CpG岛甲基化的探讨以及其他的顺式作用元件和反式作用因子对NGX6基因表达的调控的研究将是我们下一步的研究目标,以期待能更好的了解NGX6基因在肿瘤发生、发展中的作用和地位,并寻找新的针对鼻咽癌或结直肠癌相关基因转录调控失调的药物提供一个基础平台。
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