肿瘤特异性启动子调控SEA基因抗肺癌的实验研究

作     者：李奕璇 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈全

授予年度：2008年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肿瘤特异性 启动子 肺癌 SEA 

摘      要：目的: 本研究首先以红色荧光蛋白为目的基因,比较肝癌来源的hTERT启动子、肺癌来源的hTERT启动子以及Survivin启动子肿瘤特异性启动子在肺癌A549中的启动活性;选择在A549肺癌细胞中有较强启动活性的Survivin启动子为调控序列,构建pGL-S-SEA真核表达质粒;通过RT-PCR鉴定重组质粒在A549细胞中的特异性表达;通过PBMC刺激实验以MTT法检测重组质粒在A549细胞中的表达产物的超抗原活性;表达产物活化的PBMC的抗A549细胞活性的研究。本研究旨在为探索肺癌及其它肿瘤的靶向基因治疗途径及机理奠定基础。 方法: 1.用PCR法和基因克隆技术在真核表达质粒pGL3-hTERT基础上分别构建3种启动子调控的、以红色荧光蛋白为目的基因的真核表达质粒pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED。 2.将该3种重组质粒分别用脂质体转染人肺腺癌细胞(A549)和人胚肺成纤维细胞(MRC-5),72h后在荧光显微镜下观察红色荧光蛋白的表达,并用Imagepro-Plus6.0分析3种启动子在相同时间内启动红色荧光蛋白的表达水平。 3.以ATCC25923金黄色葡萄球菌基因组为模板,PCR扩增sea基因。选择在A549肺癌细胞中有较强启动活性的Survivin启动子为调控序列,以pGL-S-RED为基础,由sea基因替代其“Red基因,构建pGL-S-SEA真核表达质粒;用脂质体将该质粒转染A549细胞,72h后提取总RNA,通过RT-PCR鉴定重组质粒在A549细胞中的特异性表达。 4.用脂质体将pGL-S-SEA质粒转染A549细胞,72h后,收集细胞培养的上清液和转染细胞裂解液。制备健康献血者PBMC,用上清液和细胞裂解液进行PBMC刺激实验,并用MTT法、通过比较刺激指数以检测其促细胞增殖效应。 5.制备经细胞裂解液、上清液诱导24h后的PBMC,分别将其与A549细胞共同培养,24h后,用MTT法、通过比较其杀伤率以检测测其杀瘤效应。 结果: 1.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pGL-H-RED、pGL-LH-RED和pGL-S-RED真核表达质粒构建成功;重组质粒分别转化A549细胞和MRC-5细胞72h后,在A549细胞中观察到了红色荧光蛋白的表达,而在MRC-5细胞中无红色荧光表达。经Imagepro-Plus6.0分析,pGL-S-RED荧光蛋白在A549细胞中表达最强,pGL-LH-RED次之,pGL-H-RED最弱,在A549细胞中的荧光强度(IOD)分别为201.17、171.70和136.34。 2.经限制性内切酶酶切及DNA测序证实pGL-S-SEA真核表达质粒构建成功。质粒转化A549细胞后,RT-PCR结果表明,pGL-S-SEA质粒在A549细胞中成功表达sea目的基因,基强度为内参(GADPH gene)的65.96%。 3.经MTT实验结果证实,pGL-S-SEA质粒转化A549细胞的裂解液具有促进人PBMC增殖活性、上清液无明显促PBMC增殖作用,裂解液实验组、上清液实验组和PHA阳性对照组的刺激指数分别为1.29、0.95和1.58。 4.经MTT实验结果证实,经pGL-S-SEA质粒转化A549细胞裂解液诱导的PBMC,表现出一定的杀伤A549细胞的活性,其中裂解液实验组和对照组的杀伤活性分别为31.965%和21.116%。 结论: 1.成功构建了3种肿瘤特异性启动子调控的、以红色荧光蛋白为目的基因的真核表达质粒,3种启动子均表现出肿瘤特异性,其中Survivin启动子在肺癌A549细胞中具有最好的启动效应。 2.成功构建Survivin启动子调控的、以超抗原SEA CDS为目的基因的真核表达质粒pGL-S-SEA,并在A549细胞中启动了SEA基因的表达。 ***-S-SEA质粒在A549细胞的表达产物,具有诱导人PBMC增殖的超抗原活性,经该产物诱导的人PBMC细胞对A549细胞表现出了明显增强的杀瘤效应。