内源性肾上腺糖皮质激素对血管炎症反应抑制作用的研究

作     者：黄樾 

作者单位：广州医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：罗健东

授予年度：2009年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：内源性糖皮质激素 血管炎症反应 氧化应激 核组蛋白去乙酰化酶 

摘      要：目的: 糖尿病是以血糖持续性升高为特征并常伴心血管并发症的代谢性疾病。血管内皮细胞损伤是糖尿病导致心血管疾病如动脉粥样硬化等的起始环节。氧化应激和炎症反应已被确认是血管内皮细胞损伤的重要机制。已有研究表明生理水平的肾上腺糖皮质激素具有抗炎作用。其抗炎作用主要是通过增强核组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的活性,从而抑制促炎核因子AP-1和NF-κB的转录来实现的。最近的研究资料显示氧化应激使肺组织HDAC失活,取消了外源性肾上腺糖皮质激素的抗炎效应。这些结果提示氧化应激灭活HDAC,不仅能够取消外源性肾上腺糖皮质激素的抗炎作用,也可能削弱内源性肾上腺糖皮质激素的抗炎效应。因此,这里将主要研究生理水平肾上腺糖皮质激素对血管炎症反应的抑制作用(抗炎作用);这种内源性抗炎机制在糖尿病血管并发症中的作用和意义;以及氧化应激导致内源性抗炎机制受损的分子机制。 方法: 1.将180-220g雄性SD大鼠分为三组,分别给予RU486(肾上腺糖皮质激素拮抗剂)、TSA(HDAC抑制剂)和摘除双侧肾上腺处理后,腹腔注射LPS,取大鼠胸主动脉提取组织蛋白,ELISA法检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量、NF-κB以及HDAC活性。 2.选用6-8周龄雄性C57/B6小鼠,腹腔注射佐链脲菌素(STZ),建立1型糖尿病小鼠模型。将糖尿病小鼠分为单纯糖尿病组及抗氧化剂组,单纯糖尿病组分别于2、4、8、12周处理,抗氧化剂组分别喂以Tempol、Allopurinol、Apocynin以及联合用药于10周处理,取小鼠血清及胸主动脉,ELISA法检测肾上腺糖皮质激素含量,流式细胞仪检测细胞因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1含量,ELISA法检测NF-κB以及HDAC活性。 3.分别使用糖尿病8周小鼠,同龄正常对照组;糖尿病12周小鼠,同龄正常对照组;分别喂以Tempol、Allopurinol、Apocynin以及联合用药10周糖尿病小鼠,糖尿病10周小鼠,取血管组织进行石蜡切片和HE染色,观察各组小鼠血管形态学变化。 4.原代培养小鼠胸主动脉内皮细胞,经形态学和免疫组化鉴定后,用3-5代进行实验。分别给予LPS(内毒素)、氢化可的松、TSA等处理,取细胞上清液,EILSA法检测细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10含量、NF-κB以及HDAC活性。 结果: 1.经LPS刺激的SD大鼠,其胸主动脉内IL-1β、IL-6和IL-10的含量以及NF-κB的活性均比正常对照组显著升高(P0.05);而预先给予TSA后,大鼠胸主动脉中HDAC活性受到抑制(P0.05)。 3.糖尿病小鼠分别喂以Tempol、Allopurinol、Apocynin以及联合用药于10周处理,与正常对照组相比,各抗氧化剂对不同细胞因子表现出不同作用:Tempol、Apocynin均引起血清IL-6、IFN-γ、TNF-α水平显著下降(P0.05);Allopurinol引起IFN-γ含量降低(P0.05);联合用药引起IL-6、IFN-γ、TNF-α、MCP-1表达均大幅度下降(P0.05),但死亡率很高,存活例数不足。各抗氧化剂均能引起胸主动脉NF-κB的活性不同程度降低(P0.05),而胸主动脉HDAC活性不同程度的升高(P0.05)。 结论: 1.分别阻断糖皮质激素受体、抑制HDAC活性和摘除双侧肾上腺,均可见SD大鼠胸主动脉内细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10的含量以及促炎转录因子NF-κB的活性均明显增加,提示内源性的肾上腺糖皮质激素对血管炎症反应具有抑制作用。 2.糖尿病小鼠血清肾上腺糖皮质激素水平、细胞因子如IL-6、IFN-γ、TNF-α等水平以及胸主动脉NF-κB活性均显著升高,而胸主动脉内HDAC活性降低;应用抗氧化剂后,细胞因子水平以及NF-κB表达下降,而HDAC活性增强。由此可见,HDAC是内源性肾