人KCNJ15基因真核表达质粒的构建及其体外功能研究

作     者：徐大琴 

作者单位：华中科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宁琴

授予年度：2011年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：乙型重型肝炎 KCNJ15 真核表达质粒 免疫学 功能 

摘      要：研究背景及目的重型肝炎病情凶险,死亡率极高,发病机制极为复杂。本研究室前期利用基因芯片技术研究发现,较乙型慢性轻度肝炎(CHB)患者,KCNJ15基因在乙型重型肝炎(SHB)患者外周血单个核细胞(PBMC)表达显著上调。进一步的研究发现,KCNJ15在乙型重型肝炎(SHB)患者外周血CD4+T细胞和CD8+T细胞表达显著上调,尤其以CD4+T细胞更为显著。本研究的目的在于构建人KCNJ15真核表达质粒,通过体外转染人急性T淋巴细胞白血病T淋巴细胞(Jurkat细胞),探讨Jurkat细胞的功能变化,以探讨KCNJ15在乙型重型肝炎(SHB)发生发展过程中的免疫致病作用。 研究方法收集乙型重型肝炎患者外周血,分离PBMC后提取RNA,以逆转录后的cDNA为模板,通过设计的KCNJ15特异性引物扩增其全长开放阅读框序列(ORF),利用分子克隆技术构建KCNJ15真核表达质粒,测序明确序列正确性。利用电转染的方法将KCNJ15真核表达质粒导入Jurkat细胞,分别利用Real-time PCR和Western blot法检测基因和蛋白质水平的表达。检测转染后Jurkat细胞表面活化分子CD25、CD69的表达及细胞因子的分泌情况。 研究结果成功的构建了人KCNJ15真核表达质粒和转染Jurkat细胞系。转染KCNJ15真核表达质粒后,Jurkat细胞表面活化标志未见明显改变,Jurkat细胞的细胞因子IL-17A的表达上调、IL-9的表达下调。 研究结论成功构建人KCNJ15真核表达质粒,通过体外研究初步阐明KCNJ15促进CD4+T细胞分泌细胞因子IL-17A和抑制CD4+T细胞分泌细胞因子IL-9的免疫学功能,为进一步在体内研究其免疫学功能奠定了基础。