β防御素1基因单核苷酸多态性与脓毒症发生发展的相关性研究
作者单位：浙江大学
学位级别：硕士
导师姓名：方向明
授予年度：2006年
摘 要：研究背景 脓毒症（sepsis）系微生物入侵机体感染后所致的全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），机体促炎症反应和抗炎症反应间的不平衡及免疫功能的失调和凝血纤溶系统的异常是其发生、发展的病理生理基础。重症脓毒症（severe sepsis）、脓毒性休克（septic shock）及多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是脓毒症的后续症。脓毒症是重症监护病房（ICU）中高发及高致死率的主要疾病，它是一种环境因素（病源微生物）和遗传因素共同作用的多基因病，多个常见的、微效的遗传变异独立或相互间通过目前尚未能阐明的分子机制在脓毒症的发生、发展中起着一定的作用，不同个体对脓毒症的易感性和预后存在明显的差异，这种个体间的基因背景差异和基因多态性，影响了个体对感染及创伤所致的系统性炎症应答反应。基因决定着各种炎症介质、细胞因子的合成和释放，以往的研究提示编码炎症介质和纤溶凝血分子基因的多态性可能是脓毒症及MODS的高危预警标识。 天然免疫系统在脓毒症的发生、发展中起着重要作用，在人呼吸道上皮中具有天然免疫活性的阳离子多肽分子主要是人β防御素（human beta defensin，DEFB）和LL-37。DEFB是一类具有抗菌活性的阳离子多肽，它具有广谱的抗微生物活性的同时又具有某些免疫调节作用，如对树突状细胞及T细胞有趋化作用。DEFB1是最早发现的DEFB，研究发现DEFB1在皮肤及多种上皮组织中均有表达，它在呼吸道黏膜的抗微生物过程中起着重要作用。DEFB1的基因定位于8号染色体，p23区，在对五类人种DEFB1基因的研究中共发现了15个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs），其中7个SNP在不同人种中等位基因频率存在明显差异。尽管DEFB1是组成型表达的，但已有研究表明DEFB1基因中SNP与某些疾病存在相关性，5’非编码区的SNP与儿童HIV病毒感染、哮喘和遗传性过敏症存在相关性，而-44C／G可能与口腔黏膜假丝单胞菌感染关联，1654A／G是一个第二外显子非同义突变，曾报道日本COPD患者中等位基因G的频率高达8％，但DEFB1基因多态性是否与脓毒症的发生和预后存在相关性，至今仍无相关报道。 研究目的 通过病例一对照关联研究，探讨DEFB1基因单核苷酸多态性与脓毒症的易感性、肺损伤的严重程度及预后是否存在相关性，进而寻找有效的脓毒症相关基因标识。 方法 本研究经医院伦理委员会批准，患者知情同意后，由本人或直系亲属签字后进行。 脓毒症患者268例，均符合1992年和2001年美国胸科医师协会及危重病学会制定的脓毒症诊断标准的病人，排除孕妇及年龄小于18岁的患者。疾病严重程度采用急性生理学及慢性健康评分（APACHEⅡ）和脓毒症相关器官衰竭评分（Sepsis-related Organ Failure Assessment Score）（SOFA），呼吸系统损伤程度以氧合指数（OI）表示。对照组157例，为同期择期手术后未并发脓毒症的病人。 抽取外周静脉血10ml，以2％乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝，移取200μl全血用QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN公司）提取基因组DNA。将提取的基因组DNA溶于200μl TE缓冲液中置-80℃冰箱保存。 聚合酶联反应（PCR）扩增DNA片段及DNA直接测序-1816A／G（rs2741136）、-52A／G（rs1799946）、-44C／G（rs1800972）、-20A／G（rs11362）的测定采用PCR扩增DNA片段后DNA直接测序的方法。随机抽取30例标本，采用限制性酶切分析验证结果的准确性。 聚合酶链式反应双引物等位基因特异性扩增法（PCR-ASA）-390A／T（rs2738182）检测采用PCR-ASA的方法，分别设计两条上游引物，引物的3′端首个碱基恰好分别结合-390A／T多态位点的A和T，其余序列相同，同时设计两条不同的下游引物。每一标本均用两对引物分别扩增，将两次扩增PCR产物混合匀后抽取8μl于2％琼脂糖凝胶（0.25μg／ml溴化乙锭）电泳（90V，40min），置于紫外成像仪下分析：A／A纯合在408bp处呈现一条亮带，A／T杂合分别在408bp、263bp处有两条亮带，T／T纯合在263bp处呈现一条亮带，随机抽取30个标本进行直接测序，两种检测结果均吻合。 TaqMan检测SNP 1654G／A（rs2738047）采用TaqMan检测其基因型，引物、探针及检测设备由上海基康生物公司提供，荧光基团FAM和VIC分别标记野生型等位基因A和突变等位基因G，淬灭基团均为TAMRA。随机抽取30个标本进行直接测序，两种检测结果均吻合。 统计学处理各组中每个SNP均采用x~2进行Hardy-Weinberg（H-W）平衡检验，各组间基因型和等位基因频率比较采用x~2检验及Fisher’s Exact检验;等位基因的风险概率以比值比（OR）和95％可信区间（95％CI）表示;APACHEⅡ、SOFA评分和OI的组间比较采用Kruskal Wallis非参秩和检验。P0.05认为有显著性差异。 结果 1脓毒症组和对照组均为汉族人种，两组间的性别构成和年龄无统计学差异（P0.05）。 2各组中SNPs的Hardy-Weinberg（H-W）平衡经x~2检验P值均大于0.05，符合Hardy-Weinberg（H-W）平衡。 3 -44C／G（rs1800972）和-20A／G（rs11362）的三种基因型的构成比及等位基因频率在脓毒症组和对照组中均存在显著性差异（P0.05），在脓毒症组-44C／G位点G的频率较高（15.86％），而对照组仅为8.60％，OR为2.00（1.27-3.17）;-20A／G位点G的频率较之对照组高，分别为64.93％和55.73％，OR为1.47（1.11-1.96）。其余4个SNPs基因型的构成比及等位基因频率在脓毒症组和对照组中均无显著性差异（P0.05），其中1654G／A中等位基因A的频率为0。 4死亡组中-44C／G位点G的频率较高为22.13％，而在存活组中仅为8.43％，差异有显著性;另一SNP-1816A／G位点中等位基因G的频率在死亡组和存活组中分别为21.31％、10.48％，同样存在显著差异（P0.05）。其余SNPs中等位基因频率在死亡和存活两组中无显著性差异（P0.05）。 5脓毒症患者-1816A／G位点G／G纯合子的氧合指数较A／G、A／A的氧合指数有显著性降低（P0.05），而APACHEⅡ和SOFA评分在各基因型中无显著性差异。 结论 本研究首次报道汉族人群中DEFB1基因单核苷酸多态与脓毒症的相关性。我们发现-44C／G（rs1800972）、-20A／G（rs11362）与脓毒症的易感性相关，而-44C／G（rs1800972）、-1816A／G（rs2741136）与脓毒症的预后存在关联，-1816A／G（rs2741136）与肺损伤的严重程度有相关。尽管上述SNP在脓毒症这一复杂的多因素疾病中所起的作用我们并不清楚，但它们可能是脓毒症发生发展有效的预警标识。
同方学位论文库