血管活性药物对LPS诱导内皮细胞损伤的保护作用

作     者：常丽丽 

作者单位：山西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马朋林

授予年度：2015年

学科分类：100218[医学-急诊医学] 1002[医学-临床医学] 1010[医学-医学技术（可授医学、理学学位）] 10[医学] 

主      题：血管活性药物 脂多糖 人脐静脉内皮细胞 

摘      要：目的:研究不同血管活性药物及同一血管活性药物的不同剂量对LPS诱导的内皮细胞损伤的影响。材料:1实验细胞:人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell,HUVEC)2主要试剂及药品:ECM培养基、脂多糖、0.25%胰蛋白酶、生理盐水、PBS、胎牛血清、去甲肾上腺素、肾上腺素、多巴胺、Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒、Anne Xin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒。3主要仪器:超净工作台、止血钳、无菌剪、换药碗、无菌巾、注射器、无菌手套、离心管、离心机、微量移液器、细胞培养箱、定时恒温磁力搅拌器、立式压力蒸汽灭菌器细胞培养瓶、细胞培养板、倒置相差显微镜、全自动酶标仪、流式细胞仪。方法:1细胞培养:在无菌条件下取健康产妇正常分娩的新生儿脐带,找出脐静脉,淤血完全冲洗之后,注入0.1%II型胶原酶使其充盈,收集充盈液到离心管中离心,将上清液吸弃后加入ECM培养液,吹打制成细胞悬液,置入培养瓶中,于细胞培养箱中培养,每2天换液一次。3天后以1:3进行细胞传代,待细胞生长至一定数量后,取3代细胞用于实验。2细胞生长抑制率的检测:按照Cell Titer 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay试剂盒说明书操作。3细胞凋亡的检测:按照Anne Xin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作。4实验分组:4.1血管活性药物对内皮细胞生长抑制影响的量效关系:实验随机分为3组(见表A),并选择每组药物作用的浓度,采用MTs(四唑类化合物)方法检测不同浓度实验组的细胞生长抑制率。表A分组浓度(μmol/L)NE组0 0.01 0.1 1 10 100DA组0 0.1 1 10 100 1000E组0 0.01 0.1 1 10 1004.2血管活性药物对LPS诱导内皮细胞生长抑制影响的量效关系:4.2.1LPS诱导内皮细胞生长抑制的量效关系:用浓度为0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L的脂多糖(LPS)刺激人脐静脉内皮细胞,采用MTs方法检测其细胞生长抑制率,选取适当浓度,建立脓毒症细胞损伤的体外模型。4.2.2血管活性药物对LPS诱导内皮细胞生长抑制的量效关系:根据LPS作用的MTs实验结果,选择LPS的作用浓度为10mg/L。细胞随机分为3组(见表B),并选择每组药物作用的浓度,采用MTs方法检测不同浓度实验组的细胞生长抑制率。表B分组LPS(10mg/L)1 2 3 4 5 6 7NE组(μmol/L)control 0 0.01 0.1 1 10 100DA组(μmol/L)control 0 0.1 1 10 100 1000E组(μmol/L)control 0 0.01 0.1 1 10 100注:control(对照组)即细胞不做任何处理4.3血管活性药物对LPS诱导内皮细胞凋亡的影响:实验随机分为3组(见表C),选择每组药物作用的浓度,采用流式细胞技术,测定不同浓度实验组细胞凋亡率。表C分组LPS(10mg/L)1 2 3 4 5NE组(μmol/L)control 0 0.01 1 100DA组(μmol/L)control 0 0.1 10 1000E组(μmol/L)control 0 0.01 1 100注:control(对照组)即细胞不做任何处理5数据处理:采用SPSS16.0统计软件对实验数据进行分析。实验数据采用均值土标准差表示,采用方差分析,组间比较用多个样本均数两两比较的SNK法。P10μmol/L,DA100μmol/L)时,细胞生长抑制率明显升高,呈浓度依赖性。2血管活性药物对LPS诱导内皮细胞生长抑制影响的量效关系:2.1 LPS诱导内皮细胞生长抑制的量效关系:应用LPS刺激HUVEC后,发现细胞生长抑制率与LPS浓度成正相关(r=0.7377,p0.01),从LPS浓度为0.01mg/L时15.67%到LPS浓度为100mg/L时的79.77%,其中,细胞生长抑制50%左右时的LPS浓度为10mg/L,因此,接下来的实验选择此浓度刺激HUVEC建立体外脓毒症细胞模型。2.2血管活性药物对LPS诱导内皮细胞生长抑