血管内皮生长因子对脊髓运动神经元及其PI3/K信号通路的作用

作     者：董漪 

作者单位：复旦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：董强;王亮;韩翔;丁宏岩;陈嬿

授予年度：2010年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：血管内皮生长因子 脊髓运动神经元体外培养 兴奋性氨基酸毒性 磷脂酰肌醇3-激酶 

摘      要：第一部分脊髓运动神经元体外培养 目的探索Sprague-Dawley（SD）大鼠的脊髓运动神经元体外培养方法,为进一步研究脊髓运动神经元受累为主的神经系统退行性疾病建立体外细胞模型奠定基础。 方法无菌条件下,获得新生SD大鼠的脊髓细胞,通过梯度离心法纯化胞体较大的运动神经元。培养后,通过细胞形态学及免疫荧光染色进行鉴定。 结果培养至12小时大多神经细胞贴壁生长,培养至6天时,可获得胞体饱满,突触明显的神经元细胞。超过2周后部分细胞死亡。通过SMI-32免疫荧光染色,鉴定为脊髓运动神经元。 结论通过梯度离心法纯化的脊髓运动神经元,纯度较高。且此培养方法,操作较简单,存活率高。 第二部分外源性VEGF对大鼠脊髓运动神经元的作用探究 目的探索不同浓度血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor, VEGF）对大鼠脊髓运动神经元细胞的作用。 方法在新生SD大鼠脊髓运动神经元体外培养模型培养至第6天时,建立干预组和对照组,并设立不同的VEGF干预浓度。继续培养48h后,免疫荧光染色观察各组大鼠脊髓运动神经元的数量及形态。运用Ipwin图像分析软件及SSPS 11.5统计分析软件进行数据采集及统计分析。 结果培养至8d,通过免疫荧光染色发现,对照组与中低剂量干预组相比,细胞数量明显增加,且存在统计学差异[低剂量组107.83±40.25;中剂量组186±45.55 vs对照组66.17±24.9,P均0.05];对照组与高剂量干预组相比,细胞数量没有统计学差异（高剂量组66.83±21 vs对照组66.17±24.9,P=0.934）。通过MTT法观察脊髓前角细胞活力发现,对照组与中低剂量干预组相比存在统计学差异[低剂量组0.387±0.109;中剂量组0.489±0.161 vs对照组0.133±0.017,P均0.05];对照组与高剂量干预组相比,细胞活力没有统计学差异（高剂量组0.144±0.037 vs对照组0.133±0.017,P=0.397）。通过方差分析得出,不同的VEGF干预浓度条件下,脊髓运动神经元存活数量及细胞活力均存在统计学差异。 结论中低剂量VEGF干预时,随着VEGF浓度增高,细胞存活数量及生长活力均增加;而高剂量VEGF干预对细胞存活及细胞生长活力无益。因此,外源性VEGF对脊髓前角细胞的作用取决于干预浓度。 第三部分外源性VEGF对损伤脊髓运动神经元的作用及其PI3/K的信号通路探究 目的通过建立谷氨酸（Glu）所致脊髓运动神经元兴奋性氨基酸损伤的模型,研究不同浓度VEGF干预及PI3/K抑制剂对谷氨酸损伤的脊髓运动神经元的影响及其PI3/K的表达。 方法1)在新生SD大鼠脊髓运动神经元体外培养模型培养至第4天时,建立不同浓度Glu组及对照组,通过MTT法检测细胞活力,探索Glu模型的适宜的工作浓度。2)在新生SD大鼠脊髓运动神经元体外培养模型培养至第4天,建立对照组、VEGF组、Glu干预组及PI3/K抑制剂组,继续培养至6天。通过MTT法检测各组别运动神经元活力;免疫荧光方法观察各组大鼠脊髓运动神经元的数量及PI3/K的表达情况;用间接ELISA法半定量检测各组之间PI3/K的表达情况。用SSPS 11.5统计分析软件分析数据。 结果1)比较不同浓度Glu干预后运动神经元的细胞活力发现,对照组与Glu5uM/ml组、Glu20uM/ml组相比,P0.05,有统计学差异;GluO.5uM/ml组与Glu5uM/ml组、Glu20uM/ml组相比,P0.05,也存在统计学差异。余两两比较均没有统计学差别。2)比较各组别间运动神经元的细胞活力发现,VEGF 0.1ug/ml组与VEGF 1ug/ml组、VEGF 0.1ug/ml+Glu组相比,存在统计学差异;VEGF 1ug/ml+Glu组与VEGF 1ug/ml组、Glu组及VEGF 1ug/ml+Glu+Ly294002组均存在统计学差异;VEGF 0.1ug/ml+Glu组vs VEGF 1ug/ml+Glu组也均发现组间的细胞活力存在统计学差异。通过免疫荧光及ELISA检测运动神经元的PI3/K表达时,也得到了相似的发现。 结论1)体外培养的运动神经元随着Glu浓度增加,存活的运动神经元细胞活力降低。2)中低剂量VEGF可使脊髓运动神经元细胞数量增加、细胞活力增加、PI3/K表达增加。由Glu造成的兴奋性氨基酸毒性可以影响脊髓运动神经元PI3/K表达,对脊髓运动神经元产生损伤,且降低脊髓运动神经元PI3/K的表达。3)但VEGF可改善由Glu所造成的脊髓运动神经元损伤,增加损伤神经元PI3/K的表达。且在一定中低浓度范围内存在量效关系：VEGF浓度越高,降低Glu毒性损害的作用就越大,损伤的脊髓运动元表达的PI3/K就越高。4)通过LY294002,可以抑制VEGF增加细胞PI3/K表达的作用,降低损伤的脊髓运动神经元PI3/K的表达,抑制了其对损伤运动神经元细胞活力增加的效果。 结论 1.建立了新生SD大鼠脊髓运动神经元细胞的体外培养方法,获得细胞纯度较高,操作较简单且存活率高。 2. VEGF对脊髓运动神经元的作用：中低剂量VEGF干预时,随着VEGF浓度增高,细胞存活数量及细胞生长活力均增加;而高剂量VEGF干预：可能对细胞存活及细胞生长活力无益。因此外源性VEGF对脊髓前角细胞的作用取决于干预浓度。 3.Glu对体外培养的正常脊髓运动神经元有毒性作用,细胞存活率率与Glu干预的剂量呈负相关。即使在中低剂量VEGF干预下,Glu仍能对细胞活力造成损伤,且PI3/K表达下降。 4.中低剂量VEGF干预可使PI3/K信号蛋白表达增加,且与VEGF浓度呈正相关。 5.中低剂量VEGF干预可减弱兴奋性氨基酸毒性对脊髓运动神经元的毒性作用,使其PI3/K表达增加,可以增加细胞存活数量、增加细胞活力,且与VEGF浓度相关。 6.通过PI3/K拮抗剂抑制LY294002干预后,VEGF的上述作用减弱或消失,细胞活力及其PI3/K表达均受到损害。