Erbin在TGF-β信号通路介导的胰腺星状细胞（PSC）EMT改变中的表达

作     者：赵朕华 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：廖专

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：组织块法 胰腺星状细胞(PSC) 分离 鉴定 慢性胰腺炎(CP) Erbin TGF-β1 EMT Smad 3 ERK 

摘      要：第一部分组织块法分离培养小鼠PSC目的:利用组织块法分离培养CP模型组和对照组PSC,并分析两组分选细胞的差异。方法:雨蛙素诱导制备小鼠CP模型,HE染色观察胰腺纤维化改变;取CP组和对照组小鼠胰腺组织,胎牛血清清洗,剪切至小米粒大小贴壁培养,观察两组细胞及传代前后细胞形态学差异,采用油红O染色鉴定静息态PSC,免疫细胞化学/荧光法标记α-SMA和Desmin,荧光定量PCR对比静息和活化PSCα-SMA和Desmin的m RNA表达量;利用免疫细胞化学/荧光法标记胰腺导管细胞标志物CK19和SOX9,及腺泡细胞标志物Chymotrypsin和Amylase。结果:(1)HE染色:造模组胰腺发生纤维化改变,腺泡细胞导管化;(2)形态学观察:贴壁4天细胞多呈类圆形或星形,核周环绕脂滴,传代细胞体积增大,立体感消失,呈“星芒状,脂滴消失,CP组细胞形态体积小于对照组;(3)油红O染色:CP组和对照组早期细胞均染色,传代细胞未着色;(4)免疫细胞化学/荧光:两组细胞传代后,α-SMA和Desmin标记均阳性,CK19、SOX9、Chymotrypsin、Amylase标记均阴性;(5)荧光定量PCR:对照组传代细胞和CP组细胞α-SMA m RNA含量明显高于对照组早期细胞。结论:组织块法可成功分选CP模型组和对照组PSC,且两组贴壁早期细胞均为静息状态。第二部分Erbin及TGF-β1在CP模型组和对照组PSC中的表达差异目的:探讨Erbin及TGF-β1在CP模型组和对照组PSC中的表达差异方法:采用雨蛙素腹腔注射法制备CP模型鼠,组织块法分离提取PSC,运用荧光定量PCR和Western blot技术比较CP组和对照组PSC中Erbin及TGF-β1m RNA和蛋白表达量的差异。结果:(1)CP组Erbin表达较对照组显著升高,其转录水平为对照组的6.36倍,蛋白水平为对照组的6.79倍,P0.05;(2)TGF-β1在CP组中的表达明显高于对照组,其m RNA和蛋白分别为对照组的3.99倍和1.43倍,P0.05.结论:Erbin和TGF-β1在胰腺纤维化过程中呈一致性升高,Erbin可能通过调控TGF-β1通路参与胰腺纤维化的发生。第三部分Erbin在TGF-β1诱导的EMT过程中的表达目的:探讨TGF-β1诱导PSC活化过程中是否发生EMT样改变及Erbin和TGF-β信号通路在PSC发生EMT过程中的表达变化。方法:用10ng/ml TGF-β1刺激贴壁第4天PSC 48h,观察细胞形态改变,并采用荧光定量PCR和Western blot技术检测TGF-β1处理前后细胞E-cadherin、α-SMA、Erbin及TGF-β信号通路靶点分子的表达变化。结果:(1)TGF-β1处理过的PSC体积增大,立体感消失,脂滴减少、消失;(2)TGF-β1处理的细胞E-cadherin m RNA(0.33:1)和蛋白(0.07:1)表达均下调(P0.05),α-SMA m RNA(2.91:1)和蛋白(3.40:1)表达均上调(P0.05);(3)荧光定量PCR结果示,TGF-β1处理细胞Erbin(13.03倍)、TGF-β1(2.94倍)及其下游的Smad 3(2.08倍)和ERK(2.99倍)m RNA均表达增加(P0.05);(4)Western blot结果示,TGF-β1处理的细胞Erbin、TGF-β1、Smad 3及ERK蛋白表达均升高,分别为未处理细胞的2.28倍、1.30倍、3.15倍及1.73倍(P0.05)。结论:PSC活化过程发生EMT样改变,并上调Erbin、TGF-β/Smad通路及ERK通路靶点分子表达,参与胰腺纤维化的形成。