环境水体中肠道病毒（Enterovirus）的浓缩与检测

作     者：梁莎 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：封少龙;段招军

授予年度：2011年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100402[医学-劳动卫生与环境卫生学] 10[医学] 

主      题：肠道病毒 实时定量PCR 浓缩 病毒采集器 

摘      要：肠道病毒(Enterovirus,EV)是影响人体健康的重要病原微生物之一。本研究建立环境水体中EV的浓缩和实时定量PCR检测方法,并应用于实际环境水体中EV的浓缩和检测。 以陶瓷纳滤膜(NanoCeram)为基础,自主设计环境水体病毒采集浓缩仪,由苏州纳滤有限公司完成组装。实验室模拟水样测试病毒浓缩仪及其预处理膜、洗脱液以及蠕动泵等参数对EV病毒浓缩和回收率的影响。结果显示:模拟水样和洋桥河流水样浓缩后,浓缩液均检出EV;无预处理膜时,EV回收率为37.0%;同时使用纳滤膜和粗滤膜时回收率为12.3%;同时使用纳滤膜和微孔滤膜时病毒回收率为6.6%,三级滤膜同时使用时回收率只有5.4%;使用蠕动泵洗脱纳滤膜使病毒回收率从原来的37.0%提高到72.4%;1×PBS、0.15M NaPO和0.15M NaHPO三种洗脱液对病毒的回收率分别为46.9%、51.2%、51.7%。 从已知的阳性EV标本中扩增目的片段、克隆质粒以及鉴定;紫外分光光度测定浓度,十倍梯度稀释法配制实时定量PCR质粒标准品。建立EV实时定量PCR检测方法,并考察其特异性、灵敏度和重复性。结果表明,实时定量PCR检测方法能特异性扩增EV,不能扩增诺如病毒GI、GII型,轮状病毒,星状病毒和腺病毒;该方法在10 copies/μl全部出现典型扩增,而对标准品浓度为5 copies/μl和1 copies/μl没有全部出现典型扩增,表明实时定量PCR的灵敏度为10 copies/μl;经三次重复性实验考察,CV值均小于5%。 对北京市黄村、高碑店和小红门三大污水处理厂出水口进行EV浓缩和实时定量PCR检测。北京市三大污水处理厂出口水EV检测均为阳性,其中小红门最高分别是:(6.92±0.3)×10 copies/L、(8.13±0.4)×10 copies/L、(5.39±0.7)×10 copies/L,黄村污水处理厂次之: (6.52±1.3)×104 copies/L、(1.19±0.2)×105 copies/L、(3.31±1.5)×104copies/L,高碑污水处理厂最低: (2.72±1.0)×104 copies/L、(6.05±2.0)×104 copies/L、(2.85±1.0)×104 copies/L。 建立的环境水体EV浓缩方法可行;建立的EV实时定量PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好;北京市三大污水处理厂出水品均检测一定浓度的EV,应引起公众和相关部门的重视。