烟曲霉诱导CD4+T细胞下调miR-223-3p的表达及其对Th17细胞分化的作用机制

作     者：唐晴琴 

作者单位：第二军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：仲人前

授予年度：2016年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：烟曲霉 CD4+T细胞 miR-223-3p Th17 PRDM1 

摘      要：烟曲霉广泛存在于环境中,免疫功能正常的个体吸入小量的烟曲霉孢子并不会致病,但能引起免疫功能不全个体的严重感染,如侵袭性曲霉菌病(Invasive aspergillosis,IA)的发病率和死亡率非常高,是免疫功能不全个体死亡的重要原因。目前诊断IA的金标准主要为病理检查和微生物病原学检查,但它们存在较大的创伤性且检出率不高,而早期的对症治疗能极大改善患者的预后。因此,虽然如今的抗真菌药物已经取得了很大的进步,但仍然很难将患者体内的真菌清除干净,导致免疫功能不全个体的生命受到极大的威胁。烟曲霉侵入机体后主要引起细胞免疫应答,包括固有免疫和适应性免疫应答。固有免疫应答主要是定居在肺部的巨噬细胞、中性粒细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等通过直接吞噬作用,或者分泌一系列细胞因子和趋化因子引起炎症反应将烟曲霉孢子和菌丝杀灭。当感染进一步发展时,抗原提呈细胞(antigen presenting cells,APC)便将抗原提呈给T细胞进而启动适应性免疫应答。CD4T细胞被APC活化并进一步分化成辅助性T细胞(T helper cells,Th)介导抗真菌免疫应答。已有众多研究证实Th17参与机体的抗真菌感染免疫,且Th17和白介素-17(Interleukin-17,IL-17)引起的炎症反应与烟曲霉感染后的结局具有密切联系。但是,作为后来新发现的Th细胞亚群,Th17在烟曲霉感染引起的免疫应答中的作用机制尚不十分清楚。microRNA(miRNA)自被发现以来其功能便不断在各种疾病中得到探讨。miRNA参与调控T细胞的发育和分化,并通过影响不同Th细胞亚群之间的分化平衡调节机体的免疫状态。已有不少研究证实miRNA参与调节Th17的分化和相关细胞因子介导的炎症,对机体防御真菌感染起着至关重要的作用。如miR-172簇、miR-155、miR-326通过影响T细胞发育分化或细胞因子的产生从而促进抗感染免疫应答或抑制免疫应答;有些miRNA也可以通过调节其它免疫细胞的发育或炎症反应从而参与自身免疫疾病甚至肿瘤的发生和发展。到目前为止,miRNA在烟曲霉的致病机理和机体对烟曲霉感染后的免疫应答机制中的调节作用研究甚少,因此,本研究旨在探讨烟曲霉反应性CD4T细胞内差异表达的miRNA及其对烟曲霉诱导Th17细胞分化的作用机制。第一部分烟曲霉诱导CD4T细胞中mi R-223-3p的表达下调并向Th17分化我们先采用热灭活的烟曲霉体外负载单核细胞来源的树突状细胞(dendritic cell,DC),再将携带烟曲霉信息的DC与CD4T细胞共培养,培养出烟曲霉反应性CD4T细胞。根据前期的miRNA芯片检测结果,挑选出在烟曲霉反应性CD4T细胞内表达下调的miR-223-3p并采用RT-PCR对其进行验证,验证结果与芯片结果一致,mi R-223-3p在烟曲霉反应性CD4T细胞内的表达下调到约为对照组的0.35倍。随后我们采用流式细胞术和RT-PCR分别检测烟曲霉反应性CD4T细胞的分化和细胞因子表达的情况,我们发现经烟曲霉诱导后CD4T细胞向Th17细胞分化明显增多,且细胞因子IL-17的表达也增多,约为对照组的3.4倍(P0.05)。第二部分CD4T细胞中miR-223-3p对Th17细胞分化的影响为了进一步观察烟曲霉反应性CD4T细胞内mi R-223-3p的下调是否与Th17分化相关,我们向CD4T细胞转染miR-223-3p mimic/inhibitor,再与负载烟曲霉的DC共培养,结果发现烟曲霉反应性CD4T细胞中miR-223-3p的表达水平与Th17分化和IL-17的产生呈负相关,转染miR-223-3p mimic抑制烟曲霉反应性CD4T细胞向Th17分化和IL-17生成,而转染miR-223-3p inhibitor促进Th17分化和IL-17生成。与第一部分烟曲霉反应性CD4T细胞内miR-223-3p表达下调而Th17分化和IL-17生成增多的趋势一致,说明烟曲霉反应性CD4T细胞内miR-223-3p具有调控Th17分化的能力。第三部分miR-223-3p通过作用于靶基因PRDM1促进Th17分化本部分研究中我们通过生物信息学分析预测miR-223-3p的作用靶点PRDM1,并通过RT-PCR、Western Blot和荧光素酶报告基因技术证实miR-223-3p与PRDM1mRNA的3’UTR确实存在相互作用关系。为了探讨miR-223-3p调控Th17分化的作用是否和靶点PRDM1相关,我们向烟曲霉反应性CD4T细胞内转染PRDM1 siRNA沉默PRDM1的表达,结果显示:转染siRNA后,烟曲霉反应性CD4T细胞向Th17细胞分化减少,同时IL-17生成减少(P0.05),变化趋势与转染miR-223-3p