钙调神经磷酸酶在大鼠主动脉钙化中的作用

作     者：王志尊 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李绍冰

授予年度：2008年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：华法令 维生素D3 血管钙化 钙调神经磷酸酶 环孢霉素A 

摘      要：目的:心血管系统钙化常见于老年人及高血压、动脉粥样硬化、糖尿病和慢性肾病患者,包括动脉内膜(动脉粥样硬化相关钙化)、动脉中层(Mo¨nckeberg’s sclerosis)和心脏瓣膜钙化,无论发生在哪个部位,都会引起血流动力学和机械力学的改变,使动脉管壁僵硬,收缩压升高、舒张压降低,脉压差增大,冠状动脉灌注降低,最终将导致左室肥大、心肌缺血和心律失常,并增加卒中和猝死的危险。近几年冠状动脉钙化对于心血管事件的预测价值备受关注,较无钙化者,任何程度的冠状动脉钙化整体相对危险度为4.3,3～5年冠心病事件(心肌梗死或心源性死亡)增加4倍。深入研究血管钙化的发病机制,预防、延缓或逆转血管钙化的发生,具有重要的临床意义。 既往认为血管钙化是过饱和的钙、磷在血管壁的被动沉积,近年证实是由细胞和分子参与的、类似于骨形成的主动过程。钙调神经磷酸酶(CaN)是丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员,分类上属于PP2B家族,是唯一受Ca2+/钙调素调节的磷蛋白磷酸酶。CaN主要表达于细胞浆中,组织分布广泛,通过使底物NFAT去磷酸化和核内转位,激活下游基因转录,参与多种细胞功能调节。研究证实CaN在心肌细胞肥大和骨代谢中具有重要作用。CaN不但参与成骨细胞分化和成骨作用,还是破骨细胞分化必需的,是否参与血管钙化的调节过程,目前国内外尚未见有报道。 本试验采用华法令和维生素D3建立大鼠血管钙化模型,测定主动脉CaN mRNA、蛋白质的表达及活性,并观察CaN特异性抑制剂环孢霉素A(CsA)对CaN表达及对血管钙化的影响,初步探讨CaN对血管钙化的调节作用,为血管钙化的临床防治提供新的思路。 方法:4w SD雄性大鼠36只,体重80～90g,随机分为3组,每组12只。A组:对照组;B组:钙化组;C组:环孢霉素A组;实验第1-8天,各组均给予维生素K115mg·kg-1·d-1,皮下注射。同时,C组另给予环孢霉素A 10mg·kg-1·d-1腹腔注射;A组和B组分别给予等量生理盐水腹腔注射。第3天开始,B、C组另给予维生素D3 3×105U·kg-1·d-1,皮下注射,持续至实验第5天,及华法令15mg·100g-1,12h一次,皮下注射,持续至第8天;对照组在相同时间给予等量生理盐水皮下注射。实验第9天,所有动物麻醉后处死。开胸,暴露出心脏,分离胸主动脉,并向下剖开腹部,分离出腹主动脉,从主动脉根部至腹主动脉分叉处剪下主动脉。取材后每组各取6只用于免疫组化测定CaNB1蛋白、原位杂交测定CaNAαmRNA和透射电镜下观察超微结构的变化,6只用于组织CaN和碱性磷酸酶(ALP)活性测定。将免疫组织化学和原位杂交结果应用Image-Pro Plus图象分析软件,分别计算各组主动脉组织相同面积内阳性细胞的累积光密度值(integrated optic density,IOD)。所有数据以均数±标准差(x±s)表示,运用SPSS 13.0统计软件,首先对计量资料进行正态性检验及方差齐性检验,组间资料比较应用单因素方差分析,两两比较应用LSD-t检验,P0.05即有统计学意义。 结果:(1)HE染色结果示对照组大鼠主动脉壁结构完整,中层血管平滑肌细胞(VSMCs)排列整齐;钙化组和环孢霉素A组大鼠主动脉中层VSMCs排列紊乱,弹力纤维迂曲断裂。(2)VonKossa染色示钙化组大鼠主动脉中层弹性纤维间有大量黑色颗粒沉积;环孢霉素A组大鼠主动脉中层弹性纤维间亦可见黑色颗粒沉积;对照组未见明显黑色颗粒沉积。(3)透射电镜下可见钙化大鼠主动脉内皮细胞呈空泡变性,线粒体水肿,嵴数量减少,排列紊乱,部分嵴和细胞膜融合或消失,粗面内质网轻度扩张,有脱颗粒现象,部分膜融合或消失,吞饮小泡数量减少,细胞核轻度水肿,部分双层核膜融合或消失,核轻度不整形,轻度不规则;平滑肌细胞线粒体大部分嵴和部分核膜融合或消失,粗面内质网轻度扩张,有脱颗粒现象,部分核膜融合;平滑肌细胞外基质中可见钙盐沉积,有外膜包裹。(4)免疫组织化学结果示对照组大鼠主动脉可见少量CaNB1蛋白表达,主要位于胞浆内;钙化组大鼠主动脉CaNB1蛋白(8731.93±469.92)较对照组(5500.95±982.57)表达明显增加(P0.01);CsA组大鼠主动脉CaNB1蛋白(7712.79±539.20)较对照组(5500.95±982.57)表达明显增加(P0.01);CsA组大鼠主动脉CaNB1蛋白(7712.79±539.20)较钙化组(8731.93±469.92)表达减少(P0.05)。(5)原位杂交结果显示对照组大鼠主动脉可见CaNAαmRNA表达,主要位于胞浆中;钙化组大鼠主动脉CaNAαmRNA(26420.97±1697.97)较对照组(10302.17