TUSC3基因在结直肠癌发生发展中的作用及分子机制研究
作者单位：南方医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：林洁
授予年度：2016年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：研究背景和目的结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种常见的严重危害人类健康的消化系统恶性肿瘤。在我国常见恶性肿瘤死因顺位排名中,结直肠癌位于第三位,其中在男性肿瘤患者中排名第四,在女性肿瘤患者中排名第三。随着我国经济的发展和人们生活水平的提高,人们饮食构成与生活习惯发生了较大的改变,结直肠癌发病率在逐渐增加,并且其发病年龄明显提前,其中30至40岁的中青年结直肠癌的发病比例上升最快。尽管现在结直肠癌诊断和治疗水平都有大幅提升,但死亡率仍然没有明显下降。转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。临床上有一半以上的患者在行根治性手术之前就已经出现了微转移,它是导致结直肠癌患者术后复发和转移的直接原因。因此,深入结直肠癌发生发展过程的基础研究,全面认识结直肠癌发生转移的分子机制,寻找有效的、特异的转移相关基因,不仅对于结直肠癌的早期诊断、预后判断具有非常重要的价值,对于有效地改善结直肠癌患者的治疗效果,减少结直肠癌患者的死亡率同样具有重要的科学意义。TUSC3(tumor suppressor candidate 3)基因,也叫作N33、OST3A,位于人类第8号染色体短臂8p22。该基因全长224 kbp,含有11个外显子,在启动子和第一外显子区存在一个CpG岛。TUSC3蛋白含有348个氨基酸,4个跨膜结构域,还有1个N末端信号肽在蛋白成熟过程中被剪切(http://***/services/signalP).TUSC3定位于内质网,它是寡糖转移酶复合物中的一个亚基,具有氧化还原酶的活性,在催化蛋白质N端糖基化的过程中起着非常重要的作用。因此TUSC3的异常可引起N糖基化进程的改变,而N糖基化与肿瘤的发生及演进(侵袭和转移)密切相关。此外,TUSC3还是细胞膜表面Mg2+转运不可或缺的成员,敲除该基因的表达可引起细胞内总Mg2+浓度和游离Mg2+浓度的降低,从而影响Mg2+的吸收并导致斑马鱼发育阻滞。迄今关于TUSC3在结直肠癌中的研究主要集中于启动子的甲基化研究,而没有TUSC3的表达分析或功能研究。因此,TUSC3在结直肠癌发生及转移中究竟起着什么样的作用?它通过何种分子机制或信号通路参与结直肠癌的发生发展?这些都值得我们进一步深入研究与探讨。通过本研究,我们将揭示TUSC3在结直肠癌发生和转移中的作用及其分子机制,探讨TUSC3在此过程中可能涉及的信号通路,进一步证实TUSC3作为结直肠癌发生及转移关键基因的设想,为寻找结直肠癌的潜在治疗靶点提供实验依据,为结直肠癌发生发展的分子机制提供新的理论。方法从临床病理分析、细胞功能实验与信号通路三个主要方面对TUSC3在结直肠癌发生、发展中的作用及分子机制进行具体研究。1、TUSC3在结直肠癌细胞系、组织中的表达及其临床意义利用免疫组化技术检测TUSC3在120例结直肠癌组织与癌旁组织中的表达水平,并分析TUSC3表达差异与病人年龄、性别、TNM分期、分化程度等临床病理特征的关系。同时,用western blot方法检测TUSC3蛋白在20例结直肠癌组织与癌旁组织中的表达量,用qRT-PCR技术检测TUSC3的mRNA在10例结直肠癌组织与癌旁组织中的表达量,明确结直肠癌与癌旁组织中TUSC3蛋白水平和mRNA水平的表达差异。采用qRT-PCR技术检测TUSC3在8个结直肠癌细胞株的表达水平,筛选出TUSC3表达量相对较高和相对较低的细胞株各两株。2. TUSC3在结直肠癌细胞株中的表达与细胞功能分析首先,构建TUSC3基因过表达的质粒并进行病毒包装。其次,设计并合成3个针对TUSC3基因的shRNA片段,筛选出干扰效率最高的一个,并对表达量较高的两株细胞株进行沉默处理,对表达量较低的两株细胞株进行过表达处理,以空病毒载体转染后的细胞株为对照组,并通过western blot与qRT-PCR方法确定转染效率与表达水平的变化。然后,采用细胞增殖实验(MTT分析)检测TUSC3过表达、沉默处理后的细胞增殖能力;采用小室侵袭实验检测TUSC3过表达、沉默处理后的细胞侵袭能力;采用划痕愈合实验检测过表达、沉默处理后的细胞愈合能力;采用平板克隆实验检测TUSC3过表达、沉默处理后的克隆形成能力：采用裸鼠皮下成瘤实验检测TUSC3过表达、沉默处理后结直肠癌细胞在动物体内的成瘤能力和增殖能力。3、TUSC3在结直肠癌发生、发展中作用的分子机制研究TUSC3涉及激活PI3K/Akt、MAPK以及Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌细胞的EMT,通过western blot方法检测TUSC3过表达、沉默处理后的结直肠癌细胞内相关蛋白表达差异,明确TUSC3与PI3K/Akt、MAPK、以及Wnt/β-catenin信号通路之间的初步关系。4、统计
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