CTLA4Ig联合青藤碱对异种鼠肾移植排斥反应中Fas/FasL表达的影响

作     者：陈选才 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李建军

授予年度：2015年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：CTLA4Ig 逆转录病毒 青藤碱 异种鼠肾移植 排斥反应 

摘      要：目的本实验主要利用PLNCX2-FLAG-CTLA4Ig基因包装成逆转录病毒局部转染豚鼠肾脏,通过其表达产生的CTLA4Ig阻断CD28-B7共同刺激通路,营造免疫抑制微环境,同时联合应用青藤碱抑制受鼠外周血CD4+T细胞增殖,通过研究两者的协同作用探究其对异种鼠肾移植排斥反应中相关凋亡因子Fas/Fas L表达的影响,从而为临床治疗肾移植排斥反应及未来异种肾移植的临床应用提供新的方法和思路。方法选用雄性SD大鼠(12-14周龄)、雄性豚鼠(12-14周龄)各40只,完全随机分为4组(每组SD大鼠、豚鼠各10只)。实验分为4组,A组:空载体逆转录病毒基因转染+生理盐水空白对照;B组:空载体逆转录病毒基因转染+青藤碱;C组:CTLA4Ig逆转录病毒基因转染+生理盐水;D组:CTLA4Ig逆转录病毒基因转染+青藤碱。手术方式为先通过逆转录病毒载体将CTLA4Ig基因局部转染到豚鼠双肾,再将豚鼠双肾整体异位移植到SD大鼠颈部,其中左肾留作移植肾,切下右肾用于检测CTLA4Ig的表达。观察术后各组SD大鼠移植肾存活时间、受鼠存活时间;采用HE染色观察术后各组SD大鼠移植肾排斥反应病理分级;术后48小时受鼠尾静脉抽血查肌酐值,同时监测48小时尿量;采用Western blotting检测被切右肾CTLA4Ig的表达;Western blotting及免疫组化技术检测受鼠移植肾Fas/Fas L蛋白的表达。结果1.肌酐及尿量的监测术后48h尾静脉抽血查肌酐值:B、C组移植鼠肌酐值分别为(9.20±0.83)mg/L、(9.00±0.71)mg/L,明显低于A组(15.00±1.00)mg/L(P0.05),而D组移植鼠肌酐值最低,为(4.20±0.84)mg/L,与其他3组相比差异有显著性(P0.05)。术后48h尿量值:B、C组移植鼠尿量分别为(11.80±1.09)ml、(11.60±1.14)ml,明显高于A组(6.40±0.55)ml(P0.05),而D组移植鼠尿量最多,为(19.20±0.81)ml,与其他3组相比差异有显著性(P0.05)。2.移植肾及受鼠存活时间A组大鼠移植肾存活时间为(5.60±0.89)d,受鼠的存活时间为(6.50±0.87)d;B组、C组移植肾存活时间分别为(10.45±0.85)d、(10.85±0.80)d;受鼠存活时间为(12.40±0.86)d、(12.80±0.81)d,均长于A组(P0.05),其中D组移植肾及受鼠存活时间最长,分别为(14.80±0.85)d及(17.75±0.87)d。D组与其他3组比较,差异均有统计学意义(P0.05)。***染色各组移植肾病理切片HE染色检查结果示:术后A组移植肾组织HE染色可见大量淋巴细胞浸润,Banff09移植肾病理分级为IIB-III级,提示移植肾排斥反应强烈。B、C组移植肾也可见淋巴细胞浸润,但表达强度低于A组,Banff09移植肾病理分级为IIA-III级。而D组移植肾仅有少量淋巴细胞浸润,Banff09移植肾病理分级为IA-IIB级,明显低于其他三组。*** blotting供肾移植到受鼠颈部后,Western blotting检测到各实验组被切取右肾CTLA4Ig的不同表达,其中仅C、D组可检测到CTLA4Ig的表达,A、B组无CTLA4Ig的表达。术后各组移植肾发生排斥反应,Western blotting检测到各移植肾组织中均可见Fas/Fas L的表达。其中A组表达最强,B、C组与A组比较表达明显减弱,但两者表达差别不大,而D组表达最弱,与其他3组比较差异有显著性(P0.05)。5.免疫组织化学检测免疫组织化学技术检测各组移植肾Fas/Fas L蛋白表达显示:A组移植肾组织Fas/Fas L表达呈棕色,为强阳性表达,强阳性率100%。B、C两组移植肾组织Fas表达强阳性率分别为60%和40%,Fas L表达强阳性率分别为40%和60%。D组移植肾Fas/Fas L均无强阳性表达,Fas表达中4例呈弱阳性,1例阳性;Fas L表达中3例呈弱阳性,1例阳性。D组明显低于对照组(P0.05)。结论1、CTLA4Ig能够抑制异种鼠移植肾排斥反应,使Fas/Fas L表达降低,延长移植肾存活时间。2、青藤碱具有较强的免疫抑制作用,能抑制异种鼠肾移植排斥反应,使Fas/Fas L表达降低,延长移植肾存活时间。3、CTLA4Ig与青藤碱具有协同抗排斥作用,同时应用CTLA4Ig和青藤碱能显著减轻异种鼠肾移植排斥反应,降低Fas/Fas L表达,明显延长移植肾存活时间。