银杏外种皮提取物成分分析及其抗肿瘤免疫逃逸实验研究

作     者：王俊 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：许爱华

授予年度：2016年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：GBEE 银杏酸 重金属 LLC Fas FasL DcR3 Treg TGF-β1 免疫逃逸 

摘      要：目的：1、检测银杏外种皮提取物(Ginkgo biloba exocarp extracts, GBEE)中的银杏酸和铅(Pb)、镉(Cd)、铜(Cu)、砷(As)和汞(Hg)5种重金属元素含量,为评估其用药安全性以及建立其质量标准提供参考;2、研究GBEE抗肿瘤免疫逃逸作用,为进一步揭示GBEE的抗肿瘤药理学作用提供科学依据。方法：1、GBEE成分分析采集2013年江苏泰兴产银杏外种皮,按发明专利方法(专利号：201010251050.9)制备GBEE。采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)测定银杏酸含量;采用电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)与原子荧光光度法(Atomic fluorescence spectrometer, AFS)联合测定Pb、Cd、 Gu、 As和Hg 5种重金属元素含量。2、 GBEE抗肿瘤免疫逃逸实验建立C57BL/6J小鼠Lewis肺癌(Lewis lung cancer, LLC)移植瘤模型,将荷瘤小鼠随机分组,每组10只,分别为对照组和GBEE (50、100、200mg·kg-1)低、中、高剂量组,另设不接种肿瘤细胞的正常组。实验过程中,动态检测荷瘤小鼠肿瘤体积、小鼠体重和进食量。给药15天后,剥离肿瘤称取瘤质量并计算抑瘤率;采用H&E染色法观察肿瘤组织淋巴细胞浸润情况;采用RT-qPCR法检测肿瘤组织Fas mRNA、 Fas配体(Fas ligand, FasL) mRNA和诱骗受体3 (Decoy receptor 3, DcR3) mRNA的表达量：采用流式细胞术检测小鼠脾脏和肿瘤组织中调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)比例;采用ELISA法检测肿瘤组织上清转化生长因子-p1(Transforming growth factor beta, TGF-β1)的表达量。结果：1、成分分析结果显示,江苏泰兴产银杏外种皮经水提醇沉法制备GBEE,得率为2.05%;HPLC法测得GBEE中不含任何银杏酸成分;ICP-MS/AFS法测得GBEE中Pb、Cd、Cu、As和Hg的含量均在2010版《中国药典》限量水平以下。2、抗肿瘤免疫逃逸实验结果显示,随着肿瘤体积的增大,各组小鼠体重均有不同程度提高;与对照组比较,GBEE (50、100、200mg·kg-)各剂量组均不同程度提高了小鼠进食量。给药15天后,GBEE各剂量组移植瘤质量均明显低于对照组(P0.01或P0.001),抑瘤率分别为32.33%、34.79%和46.89%。H&E染色结果显示,与对照组比较,GBEE中、高剂量组可见较多淋巴细胞浸润于肿瘤间质;GBEE低剂量组淋巴细胞稀疏散在分布于肿瘤组织间隙。RT-qPCR结果表明,GBEE中、高剂量组可明显上调肿瘤细胞Fas mRNA表达率(P0.05或P0.01),GBEE高剂量组可显著下调肿瘤细胞FasL mRNA表达率(P0.05)和DcR3 mRNA表达率(P0.05)。与对照组比较,GBEE各剂量组均显著降低小鼠脾脏中Treg比例(P0.05或P0.01),GBEE中、高剂量组能显著降低荷瘤小鼠肿瘤组织中Treg比例(P0.05或P0.01)。GBEE各剂量组均可显著降低肿瘤组织TGF-pi表达量(P0.05或P0.01)。结论：1、江苏泰兴产GBEE中不含任何银杏酸成分;Pb、Cd、Cu、As和Hg 5种重金属元素含量符合2010版《中国药典》限量规定。2、 GBEE可干预LLC细胞免疫逃逸,其机制可能与调节肿瘤自身Fas/FasL系统和DcR3的表达以及降低机体免疫系统和肿瘤微环境Treg比例有关。